过钒酸钠对照射后BET

【关键词】  BET-2细胞；电离辐射；线粒体跨膜电位(ΔΨm)；细胞凋亡；过钒酸钠

　　摘要： 目的   研究酪氨酸磷酸酶抑制剂过钒酸钠（Pervanadate，Per）对电离辐射作用后细胞线粒体膜电位(ΔΨm)改变和细胞凋亡的影响。方法   应用流式细胞仪测定电离辐射作用后鼠源性髓系白血病细胞株BET-2细胞线粒体膜电位及其在过钒酸钠干预后的改变和细胞凋亡水平。结果   电离辐射早期可引起BET-2细胞线粒体膜电位降低，诱导细胞凋亡发生；过钒酸钠在一定程度上稳定细胞线粒体膜电位，减少细胞凋亡。结论   过钒酸钠可逆转电离辐射诱导的细胞线粒体膜电位的降低，减少造血细胞凋亡的发生。

　　关键词： BET-2细胞；电离辐射；线粒体跨膜电位(ΔΨm)；细胞凋亡；过钒酸钠

　　Effects of pervanadate on MMP of BET-2 cells induced by ionizing irradiation  

　　Abstract： Objective   To study the effects of pervanadate(Per),the inhibitor of protein tyrosine phosphotases on the alterations of mitochondrial membrane potential(MMP)and the apoptosis of BET-2 cells induced by ionizing irradiation.Methods   BET-2 cells were divided into Per-treated groups and non-Per groups and incubated after ionizing irradiation.The MMP and apoptosis were measured with FCM.Results   After irradiation was given,the MMP of BET-2 cells was reduced in the early stage significantly,and the apoptosis appeared,and these changes had a dose-dependent pattern and a time-course fashion.Per potently enhanced the MMP of BET-2 cells and prevented irradiation-treated cells from apoptosis.Conclusion   Per reversed the repression of mitochondrial membrane potential and suppress apoptosis induced by ionizing irradiation in the hematopoietic cells.

　　Key words： BET-2 cell;ionizing irradiation;mitochondrial membrane potential(MMP,ΔΨm);apoptosis;pervanadate(Per)
     
　　细胞凋亡是电离辐射导致造血系统损伤的主要方式。预防与控制造血干/祖细胞大量凋亡，有效恢复机体造血功能，在未来可能爆发的核事故、核战争以及肿瘤放射副反应控制等领域都具有十分重要的意义〔1〕。造血细胞信号转导过程受蛋白质酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphotases，PTP）的调控〔2〕。过钒酸钠（pervanadate，Per）作为PTP特异性抑制剂，参与细胞内多条信号通路信息的传递过程的调节〔3〕。通过改变PTP活性调控造血细胞受体信号转导通路，可能成为继重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、促红细胞生成素（EPO）、重组血小板生长因子（TPO）等细胞因子之外的促进辐射造血损伤修复的方向〔4〕。本研究观察Per对照射后BET-2细胞线粒体膜电位改变及细胞凋亡的影响，探讨调控造血细胞受体信号通路中PTP活性对造血细胞电离辐射损伤的保护作用。结果报告如下。

　　1   材料与方法

　　11   材料  

　　111   BET-2细胞   BET-2细胞为促红细胞生成素（EPO）依赖的鼠源性髓系白血病细胞株(军事医学院第3研究所张明伟惠赠)。悬浮于含10％马血清的1640完全培养基中，加入EPO至终浓度为2U/ml，置37℃，5％CO2孵箱培养，隔日换液，取指数生长期细胞用于试验。

　　112   主要试剂与仪器   罗丹明123、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT,美国Sigma公司)。原钒酸钠（NaVO3）、双氧水（H2O2）：用双蒸水配制为200mmol/L的储存液，过滤除菌，4℃保存。促红细胞生成素（EPO）活性为1×105U/mg，纯度>95％，由北京放射医学研究所汤仲明教授提供。MODEL 450型酶联仪（美国BIO-RAD公司）；FACSCalibur型流式细胞仪（美国Becton Dickson公司）。

　　12   方法  

　　121   照射条件   军事医学科学院放射医学研究所60Coγ射线照射源，一次照射剂量分别为3，5Gy，剂量率为148～157Gy/min。

　　122   Per制备〔5〕   将200mmol/L原钒酸钠50μl及200mmol/L H2O250μl加入400μl 1640培养液中，21℃水浴反应15min，加入5μlH2O2酶终止反应。用1640培养液稀释成应用液现配现用。

　　123   MTT方法   将待测细胞用RPMI 1640培养液洗涤3次，台盼兰染色计数活细胞，用上述完全培养基分为无Per组及Per实验组（Per终浓度为5μmol），调整细胞浓度至3×105/ml，每孔100μl加入96孔板中；Per用RPMI 1640递减稀释后，每孔加入100μl，每组做3个复孔，37℃培养48h，加MTT(50mg/ml)20μl，继续培养4h，离心，弃上清，加入200μl二甲基亚砜（DMSO），振荡助溶，在MODEL450酶联仪上测492，630nm双波长的A值，以Per浓度指数为横坐标，以A值纵坐标绘图。应用ORIGIN version294软件中Logistic程序进行拟合处理分析。

　　124   细胞线粒体膜电位(△Ψm)测定〔6〕   取1×105细胞，PBS洗涤2次，加入罗丹明123储存液至终浓度为10μmol/L，室温下平衡30min，PBS洗涤3次，PBS稀释至细胞浓度为1×105/ml，上机检测，激发光波长为488nm，计数1×104个细胞，测定细胞相对荧光强度，数据经流式细胞仪Kolmogorov-Smirnov Statistics软件进行结果分析。

　　125   细胞凋亡检测   按德国宝灵曼公司Annexin-V-FLUOS凋亡分析试剂盒说明书进行。取约1×106细胞，PBS洗涤，200g×5min，弃尽上清，重悬于100μlAnnexin-V-FLUOS标记缓冲液［1000μl溶液Ⅲ中预先加入20μlAnnexin-V-FLUOS单抗及20μl50μg/ml溴化丙锭(PI)］中，避光，室温放置10～15min，加溶液Ⅲ(100mmolHepes/NaOH,pH74,140mmolNaCl,5mmolCaCl2)04ml，上机检测。

　　2   结果

　　21   BET-2对EPO细胞增殖反应性（图1）   培养基中EPO浓度<05U/ml时，BET-2细胞增殖停止；在1～2U/ml之间即有良好促增殖作用；EPO浓度>4U/ml，其促增殖能力已达饱和。表明BET-2细胞对EPO有较好的依赖性，保持了稳定的生物学特性。

　　图1   BET-2对EPO的增殖反应性（略）

　　22   Per对BET-2细胞增殖反应性（图2）   当Per浓度<005μmol/L时，对细胞无明显效果；Per≥625μmol/L时，导致细胞死亡；而在1～3125μmol/L时可明显促进BET-2细胞在缺乏EPO状况下的增殖。提示适量Per具有细胞因子样作用，可促进BET-2细胞增殖。因此，在下述实验中，使用Per的终浓度为5μmol/L。

　　图2   BET-2对Per的增殖反应性（略）

　　23   Per对电离辐射所致BET-2细胞增殖抑制的影响（图3）   对于未照射的BET-2细胞，适当浓度Per可明显促进BET-2细胞在缺乏EPO状况下的增殖；对于5Gyγ射线照射后的BET-2细胞，1～3125μmol/L的Per仍能明显促进BET-2细胞在缺乏EPO状况下的增殖。提示电离辐射可能导致细胞信号转导过程中负调控―酪氨酸磷酸酶作用的增强，抑制细胞的增殖。

　　24   Per对电离辐射后BET-2细胞MMP改变的影响   未处理的BET-2细胞相对荧光强度为18111±899，3Gy照射细胞相对荧光强度为16420±870，5Gy照射细胞相对荧光强度为13093±910，组间比较差异均有统计学意义(P<001)，表明随着照射剂量增加，细胞线粒体膜电位(△Ψm)呈逐渐下降的趋势。5Gy照射12h后细胞相对荧光强度为10263±856，而照射即刻加入Per（终浓度为5μmol/L），细胞相对荧光强度为16837±915(未处理的BET-2细胞相对荧光强度为18359±1422)，组间比较差异有统计学意义(P<001)，表明Per可明显缓解照射后BET-2细胞线粒体膜电位(△Ψm)下降的程度。

　　25   Per对电离辐射后BET-2细胞凋亡的影响   5Gy照射后12h,存活细胞（LL象限）比例为6729%,凋亡及坏死细胞（UL+UR+LR象限）达到3271%；照射后即刻加入Per（终浓度为5μmol/L）,存活细胞9343%，凋亡及坏死细胞仅为657%，组间比较差异有统计学意义（P<001），表明Per可显著减少照射后BET-2细胞凋亡的发生。

　　图3   照射前后BET-2细胞对Per增殖反应性（略）

　　3   讨论

　　研究表明,凋亡细胞在表现出明显的核凋亡之前，线粒体失去其跨膜电势-线粒体膜电位（MMP），这种膜电位的崩解出现在许多类型的细胞中。线粒体膜电位的改变是细胞凋亡效应阶段前的一个重要标志〔6,7〕。本研究结果表明,电离辐射可导致鼠源性EPO依赖的BET-2细胞线粒体膜电位(△Ψm)下降，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。而在照射后即刻加入适量PTP特异性抑制剂Per，则可明显缓解受照后BET-2细胞线粒体膜电位(△Ψm)下降趋势，显著减少电离辐射诱导的细胞凋亡，有效促进受到辐射损伤BET-2细胞的存活、增殖。Per对辐射损伤后的BET-2细胞有一定的保护作用。结果提示，电离辐射可能直接或间接地激活了蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)负调控过程，从而引发造血细胞受体增殖信号抑制，导致细胞线粒体膜电位(△Ψm)下降，可能是辐射诱导细胞凋亡的机制之一〔8〕。

　　〔1〕   罗庆良，从玉文，郝 静，等.造血因子与急性放射病［J］.解放军医学杂志，2005，30（3）：186-190.

　　〔2〕   Cohen J，Oren-Young L，Klingmuller U，et al.Protein tyrosine phosphatase 1B participates in the down-regulation of erythropoietin receptor signalling［J］.Biochem J，2004，377(Pt 2):517-524.

　　〔3〕   Tonks NK.Redox redux:revisiting PTPs and the control of cell signaling［J］.Cell，2005 ，121(5):667-670.

　　〔4〕   Lawson AE，Bao H，Wickrema A，et al.Phosphatase inhibition promotes antiapoptotic but not proliferative signaling pathways in erythropoietin-dependent HCD57 cells［J］.Blood，2000 ，96(6):2084-2092.

　　〔5〕   从玉文，陈家佩，邵源.辐射后造血细胞对造血因子增殖反应性变化的研究〔J〕.军事医学院院刊，1999，23（2）：119-122.

　　〔6〕   张海涛，张海风，祝其锋，等.鲎血细胞多肽诱导HL-60细胞凋亡时线粒体膜电位的变化〔J〕.癌症杂志，2002，12：123-126.

　　〔7〕   Tefano Salvioli,Cristiana Barbi,Jurek Dobrucki.Opposite role of changes in mitochondrial membrane potential in different apoptotic processes〔J〕.FEBS Letters,2000,469:186-190.

　　〔8〕   Paling NR，Welham MJ.Tyrosine phosphatase SHP-1 acts at different stages of development to regulate hematopoiesis［J］.Blood，2005，105(11):4290-4297.