谷氨酸转运体抑制剂DHK抑制脑缺血预处理的保护作用

【摘要】  目的： 观察谷氨酸转运体GLT1抑制剂二氢卡因酸盐（DHK) 对脑缺血预处理(CIP)诱导脑缺血耐受的影响. 方法：采用四血管闭塞法制作大鼠全脑缺血模型，右侧脑室注射DHK. 脑组织切片硫堇染色法观察海马CA1区锥体神经元迟发性死亡（DND）程度，确定组织学分级. 结果：假手术组和CIP组海马CA1区未见明显的DND；损伤性缺血组海马CA1区有明显的DND；CIP+损伤性缺血组海马CA1区DND不明显； DHK+CIP+损伤性缺血组中，DHK阻断了CIP对海马CA1区锥体神经元的保护作用. 定量分析发现，DHK+CIP+损伤性缺血组较CIP+损伤性缺血组的保护效应明显降低. 结论：DHK可抑制CIP诱导的脑缺血耐受.

【关键词】  脑缺血预处理；二氢卡因酸盐；海马

　　0引言

　　脑缺血预处理（cerebral ischemic preconditioning, CIP）诱导脑缺血耐受（brain ischemic tolerance, BIT）由日本学者Kitagawa等［1］于1990年首先发现. 这一现象的发现，为研究机体内源性抗缺血性损害的机制提供了新的思路，因此成为人们关注的热点，BIT诱导的机制也在不断得到阐明. 既往对BIT产生机制的研究多着眼于神经元本身抗缺血性损伤的机制，而CIP是否可通过胶质细胞而诱导BIT尚未见报道. 本试验旨在观察星形胶质细胞谷氨酸转运体GLT1是否参与了CIP诱导的BIT.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　雄性Wistar大鼠（280~320 g） 36只，由河北医科大学实验动物中心提供. DHK和硫堇均购自美国Sigma公司.

　　1.2方法

　　1.2.1动物模型的制备

　　采用四血管闭塞法制造大鼠全脑缺血模型［2］. 侧脑室注射：100   g/L水合氯醛350 g/kg腹腔麻醉，将大鼠固定于脑立体定位仪上，参照脑立体定位图谱，用微量进样器向右侧脑室注射GLT1特异性抑制剂DHK 20 μL.    将凝闭双侧椎动脉2 d的动物随机分为6组：①假手术组（n=6）：只暴露双侧颈总动脉，不阻断血流；②CIP组（n=6）：夹闭双侧颈总动脉3 min；③损伤性缺血组（n=6）：夹闭双侧颈总动脉8 min；④CIP+损伤性缺血组（n=6）：夹闭双侧颈总动脉3 min作为CIP，再灌注2 d后再夹闭8 min；⑤100 nmol/L DHK+CIP+损伤性缺血组（n=6）；⑥200 nmol/L DHK+CIP+损伤性缺血组（n=6）；⑤⑥两组右侧脑室注射DHK，20 min后夹闭双侧颈总动脉3 min，2 d后夹闭双侧颈总动脉8 min.

　　1.2.2观察指标以上各组动物末次手术后7 d断头取脑，冠状切取视交叉后1至4 mm脑组织，常规脑组织切片，片厚5 μm，硫堇染色观察海马组织学改变. 参照Kato等［3］分级方法，于光学显微镜下将海马CA1区组织学改变分为0, Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ级，取双侧平均等级作为统计值. 高倍镜下计数海马CA1区每1 mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目，每张切片双侧海马各计数3个区段取平均数为神经元密度（ND）. 以下参数对CIP的保护效应作定量分析：①保护数（PN）:CIP+损伤性缺血组及DHK+CIP+损伤性缺血组与损伤性缺血组之间的ND值差值；②保护指数（PI）：保护数与假手术组的ND值之比③增长指数(GI):保护数与损伤性缺血组的ND值之比.
　
　　统计学处理: 应用SPSS软件进行统计分析. 统计学方法为非参数秩和检验，多组比较为Kruskal?Wallis检验，两两比较用Willoxon检验.

　　2结果

　　2.1海马组织学表现

　　假手术组海马CA1区锥体细胞排列整齐，形态完整，胞核饱满，核仁清晰，尼氏体丰富. CIP组大鼠海马组织形态与假手术组基本一致，仅CA1区有个别锥体细胞胞核固缩，核膜凹陷，核质浓染，核仁模糊不清，胞体及胞核形态不规则，但无明显细胞缺失. 损伤性缺血组中，可见明显的组织损伤，表现为海马CA1区锥体细胞稀疏，排列紊乱，残存的锥体细胞周围可见大量细胞碎片，其中伴有胶质细胞浸润. CIP＋损伤性缺血组海马组织学表现较相对应的损伤性缺血组明显好转（P<0.01）. DHK+CIP+损伤性缺血组中，DHK抑制了CIP对海马CA1区锥体神经元的保护作用(图1,表1).
表1DHK对脑缺血预处理诱导海马CA1区脑缺血耐受的影响(略）
　　
　　2.2CIP对大鼠海马神经元保护效应的定量分析

　　定量分析CIP对海马神经元保护效应发现，DHK+CIP+损伤性缺血组较CIP+损伤性缺血组的PN明显减少，PI明显降低，GI明显减少，且随着剂量的增大，其变化越明显（表2）.表2脑缺血预处理对大鼠海马CA1区神经元保护效应的定量分析(略）

　　3讨论

　　脑缺血时，细胞外间隙中谷氨酸浓度大大增高，主要通过神经细胞膜上的谷氨酸受体起作用［4］,产生细胞毒性作用. 研究表明，许多内源性触发因子或介质参与CIP的细胞保护作用［5］. 但CIP是否可通过胶质细胞谷氨酸转运体GLT1参与诱导BIT而实现其保护作用尚未见报道. 海马组织对缺血性损伤十分敏感，尤其是CA1区神经元 ［6］，短暂的脑缺血可以选择性地损伤CA1区神经元，而海马其它亚区和其它脑区神经元不受损伤. 本实验结果发现，3 min的CIP对2 d后8 min脑缺血再灌注海马CA1区锥体神经元产生保护作用. 应用谷氨酸转运抑制剂DHK可抑制CIP对8 min脑缺血再灌注海马CA1区锥体神经元的保护作用，从而引起神经元的死亡，且随着DHK剂量的增大，神经元死亡越明显，即CIP的保护作用被预先注射DHK所降低或抑制，这些结果提示CIP有可能通过诱导GLT1数量增多或功能增强，增加谷氨酸的摄取，防止或减轻其兴奋性毒性，而参与脑缺血耐受的诱导. 从保护效应分析也发现，随着DHK剂量增大，CIP对脑缺血的保护效应被抑制得越明显，从而证实了GLT1参与了CIP诱导的BIT.

【】
  　　［1］Kitagawa K, Matsumoto M, Tagaya M, et al.“Ischemic tolerance” phenomenon found in the brain ［J］. Brain Res, 1990, 528(1): 21-24.

　　［2］Pulsinelli WA, Brierley JB. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat ［J］. Stroke, 1979, 10(3): 267-272.

　　［3］Kato H,Liu Y,Araki T,et al. Temporal profile of the effects of pretreatment with brief cerebral ischemic on the neuronal damage following secondary ischemic insult in the gerbil:cumulative damage and protective effects［J］. Brain Res,1991,553:238-242.

　　［4］李树合, 章翔, 费舟,等. 谷氨酸释放抑制剂riluzole对弥漫性脑损伤的保护作用［J］.第四军医大学学报, 2000, 21(2): 164-166.

　　［5］Yellon DM，Baxter GF，Garcia?Dorado D，et al. Ischemic preconditioning: present position and future directions［J］. Cardiovasc Res, 1998,37(1):21-33.

　　［6］黄克维. 神经病［M］. 2版. 北京: 人民卫生出版社, 1989:54-62