ELISA检测p24抗原用于诊断HIV感染的研究现状

　　1  HIV感染实验诊断的研究概况

　　HIV主要通过性接触、血液和母婴传播。近年来，欠发达国家的感染人数超过发达国家。预计到2010年我国感染HIV的人数将超过1 000万。目前测定血清HIV抗体是诊断HIV感染的常规实验方法，但是测定HIV抗体有局限性：有超过70%的HIV感染者在感染6个月后才能检测出抗体，在同性恋群体，这个数字超过80%，检测技术增加了HIV“窗口期”传播的危险［1］；新生儿产生抗体需要出生1年后，来自母亲的HIV抗体会致使假阳性产生；HIV抗体持续存在，艾滋病晚期时消失，无法作为监测的稳定指标。

　　2  p24的来源和实验价值

　　24 kDa的蛋白质p24是HIV病毒颗粒的主要结构蛋白，在病毒的包装和成熟过程中起重要作用。p24蛋白的氨基酸序列在HIV各毒株之间高度保守，缺失p24会导致病毒无法正常组装。衣壳蛋白p24特异性很强，与多数其他逆转录病毒无交叉反应，可以用于HIV感染的早期诊断，抗HIV药物疗效的检测及HIV感染者为艾滋病的动态观察。HIV?1感染机体后, 感染者血液中最早出现的是病毒gag基因表达产物p24抗原, 然后才出现相应的特异性抗HIV抗体, 以后随抗体滴度的升高p24抗原含量呈逐渐下降的趋势, 以至检测不出。 在病情发展后期, 病毒大量复制, 机体免疫力下降, 所产生的抗体不足以中和病毒抗原时, p24抗原在血中又可测出。HIV阳性母亲所生育的婴儿30%可能已受到感染,但由于婴儿体内母源性抗HIV抗体可持续13个月～21个月之久,常规检测抗HIV抗体不适用于婴儿,而p24抗原的检测则可弥补这一不足。

　　3  p24抗原用于HIV感染的诊断

　　HIV?1和HIV?2 的p24抗原不同，但有轻微的交叉反应。因HIV?2主要局限于西部非洲，目前p24抗原的研究主要针对HIV?1感染。Schüpbach J比较245份HIV?1感染成人不同阶段的血样，发现血浆中p24抗原浓度高于血清［2］，因此建议检测血浆中p24抗原。p24抗原测定主要存在的问题：机体产生针对p24的抗体，抗原抗体结合形成免疫复合物。感染初期，随着抗体大量产生，免疫复合物形成，游离p24抗原减少，致使ELISA测定p24抗原得出假阴性结果。为提高p24检测HIV感染的敏感度，在检测之前需要将抗原抗体复合物分开。将抗原从免疫复合物上分开主要通过加热和酸碱中和。酶标记抗原斑点试验（Enzyme Labelled Antigen Spot Test,ELAST）能显著提高ELISA实验的敏感度和特异度。

　　3.1  实验步骤  患者血浆用0.5%三硝基甲苯稀释至1∶6比例后100 ℃加热5 min。已知浓度0 pg/ml、0.5 pg/ml、1 pg/ml、2.5 pg/ml、5 pg/ml、20 pg/ml、40 pg/ml、80 pg/ml的p24抗原作为对照同时操作。所有标本（100 μl/份）加入微孔中37 ℃孵育60 min后，用稀释的磷酸盐缓冲液（PBS）洗板后，加入100 μl用辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗p24抗体，再37 ℃孵育60 min。洗板后，来自ELAST ELISA系统的100 μl生物素酪胺加入微孔中，室温下孵育60 min。再次洗板后，来自ELAST ELISA系统的链霉素辣根过氧化物酶用1%小牛血清?PBS?吐温20 ml溶液稀释至1∶500，取100 μl加入每个孔中，室温下孵育30 min后洗板。100 μl四甲基联苯胺底物加入微孔中，室温下孵育30 min。然后加入100 μl 1 mol/L的硫酸终止显色反应。15 min内450 nm测定吸光度，当吸光度＞0.12时被认为是阳性［3］。

　　3.2  敏感度和特异度  Sutthent R等发现采取ELAST ELISA方法测定血浆p24的线性范围是0.5 pg/ml～80 pg/ml。针对新生儿感染HIV的检测，p24检测的敏感度(100%)与HIV?1 RNA检测的敏感度相同，高于检测HIV?1 DNA（61.9%），三种方法的特异度都可达100%［3］。Schupbach J等研究390例HIV感染母亲生产的婴儿，发现经过中和抗体，p24检测的特异度可达100%，在125例感染HIV的儿童中，p24检测敏感度可达97%高于PCR检测HIV DNA（96%）和病毒培养结果（77%）。普通采用免疫复合物分离技术测定p24抗原的方法敏感度低，而且只能检出50%没有症状的HIV患者。如今已有商品化试剂盒（bioMerieux）采用ELAST ELISA方法检测p24抗原，其敏感度和特异度能和PCR检测HIV?1 RNA相媲美。

　　4  检测p24抗原的方法临床价值评判

　　4.1  p24抗原用于HIV?1的早期诊断  成人HIV感染至抗体阳转需要6个月时间［1］。p24抗原在感染早期，病毒大量复制而抗体产生很少时就能被检测出来［4］。通过检测血浆p24抗原，可以将“窗口期”减短至20 d，此时抗体尚为阴性［5，6］。因此对献血员进行p24抗原筛查很有必要性。美国FDA已规定, 自1995年8月起, 所有全血、 成分血、 白细胞和原料血浆的献血员, 在献血前必须进行HIV?1抗原的筛选。HIV感染母亲是所生育的新生儿中30%会感染HIV。检测脐带血和新生儿血浆中的p24抗原可判断新生儿感染HIV是先天性还是在产道中感染所致。感染HIV新生儿早期使用齐多夫定（zidovudin）可降低HIV母婴传播的危险率［7］。

　　4.2  p24抗原用于HIV治疗的监测  目前主要是把血液中HIV?1 RNA的数量作为何时开始治疗以及治疗是否有效的标志。因p24抗原感染后20 d即可从血浆中检测出来， 并且伴随抗病毒治疗，血液循环中的p24抗原的量会减少。采用ELAST ELISA测定p24抗原的方法，最低可检测到0.5 pg/ml的浓度，相当于每毫升有100个病毒，而HIV?1 RNA检测正常低限是小于400拷贝/ml。故ELAST ELISA测p24抗原的阈值小于测定HIV?1 RNA，并且两种方法的敏感度和特异度都相同。相比之下，p24抗原更适合作为治疗何时开始以及治疗是否有效的标志物。美国艾滋病临床实验组认为，血浆p24浓度下降一半表明抗病毒治疗有效，p24浓度持续升高表明缺乏有效治疗［2］。

　　5  前景与问题

　　目前临床可以用于检测HIV感染，并监测疾病进展的方法有：HIV抗体检测、p24抗原检测、HIV核酸检测以及T淋巴细胞计数。总的来说ELISA检测抗体和p24抗原的方法是比较，省时，同时也比较节省人力资源的。由于献血者需要同时作HIV抗体和p24抗原检测，比较费时，国外已有第四代HIV?1 抗体/HIV?2 抗体/p24抗原联合检测HIV的商品试剂盒。两项检测同时进行，大大减少了时间，尤其适用于大标本量的筛查。HIV病毒致病机制主要是蛋白的作用，而非RNA，所以检测p24抗原能比检测HIV RNA直观地预测爱滋病进展。ELAST ELISA测定血浆p24抗原作为一种操作简单、经济、省时高效的实验方法，具有良好的敏感度和特异度，检测阈值较HIV?1 RNA检测还低。可以作为抗体阴性的疑似HIV感染者的检测，献血者的筛查，HIV感染母亲生产婴儿的检测以及决定何时开始和抗病毒治疗是否有效的监测指标。主要存在的问题：现在对于p24抗原的研究集中于B亚型，Bonard等研究发现在非洲HIV?1 CRF02_AG株感染患者中，当RNA水平低于5 log10 copies/ml时，p24抗原和HIV?1 RNA的相关性很低（r=0.33）。Burgisser等研究发现在大多数非B亚型感染中，p24抗原和HIV?1 RNA的相关性为0.39［8］,在进行干扰治疗时，p24抗原水平和HIV?1 RNA水平变化并不平行［9］。所以还需要得p24抗原到对于诊断HIV?1非B亚型感染的实验证据。

　　：

　　［1］  Puchhammer?Stockl E，Schmied B，Rieger A，Sarcletti M， et al. Low Proportion of Recent Human Immunodeficiency Virus (HIV) Infections among Newly Diagnosed Cases of HIV Infection as Shown by the Presence of HIV?Specific Antibodies of Low Avidity［J］. Journal of Clinical Microbiology,2005,43(1):497?498.

　　［2］  Schüpbach J,Measurement of HIV?1 p24 Antigen by Signal?amplification?boosted ELISA of Heat?denatured Plasma is a Simple and Inexpensive Alternative to Tests for Viral RNA［J］.AIDS REVIEWS,2002,4:83?92.

　　［3］  Sutthent R，Gaudart N,Chokpaibulkit K, et al. p24 Antigen Detection Assay Modified with a Booster Step for Diagnosis and Monitoring of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Infection［J］. Journal of Clinical Microbiology,2003,41(3):1016?1022.

　　［4］  Darr E,Moudgil T,Meyer R, Transient high levels of viremia in patients with primary human immunodeficiency virus type 1 infection［J］. The New England Journal of Medicine,1991,324:961?964.

　　［5］  Alter HJ, Epstein JS, Swanson SG, et al. Prevalence of immunodeficiency virus type 1 p24 antigen in US blood donors—an assessment of the efficacy of testing in donor screening［J］.The New England Journal of Medicine,1990，323：1312?1318.

　　［6］  Saville R,Constantine N,Cleghorn F, et al. Fourth?Generation Enzyme?Linked Immunosorbent Assay for the Simultaneous Detection of Human Immunodeficiency  Virus Antigen and Antibody［J］. Journal of Clinical Microbiology,2001,39(7):2518?2524.

　　［7］  Abrains EJ．Matheson PB，Thomas PA, et al．Pediatrics,1995,l99：451?458.

　　［8］  Burgisser P,Vernazza P,Flepp M, et al.Performance of five different assays for the quantification of viral load in persons infected with various subtypes of HIV?1［J］.Acquir. Immune Defic Syndr,2000,3:138?114.

　　［9］  Prado J,Shintani A,Bofill B, et al.Lack of longitudinal intrapatient correlation between p24 antigenemia and levels of human immunodeficiency virus (HIV) type 1 RNA in patients with chronic HIV infection during structured treatment interruptions［J］. Journal of Clinical Microbiology.2004,42:1620?1625.