乙肝小三阳血清HBV?DNA定量检测及其与前S1关系的研究

［摘  要］ 目的：检测乙型肝炎小三阳患者HBV?DNA含量，并与前S1抗原(Pre?S1)进行比较分析。方法：收集351例乙型肝炎小三阳患者血清和30例正常体检者血清，用ELISA方法检测前S1抗原，用荧光定量PCR方法定量检测HBV?DNA。结果：HBsAg、抗?HBe、抗?HBc阳性(小三阳)患者HBV?DNA检出率为62.7%(4.5×106 copies／ml)，前S1抗原检出率为72.9%。结论:HBeAg转阴者也存在病毒复制，HBV?DNA与前S1抗原相关性较好，对于乙型肝炎患者在常规血清学标志物检测的基础上对HBV?DNA数量进行动态检测有助于临床诊断、疗效观察及预后判断。

　　［关键词］ 乙型肝炎；HBV?DNA；前S1抗原

　　Study the Relationship of HBV?DNA Quantitatively Detection and Pre?S1 for the  Patients of Hepatitis B with Positive of HBsAg、Anti?Hbe and Anti?HBc

　　　Abstract：Objective To determine hepatitis B virus?DNA(HBV?DNA) and pre S1 antigen in patients with hepatitis B and expolore their different clinical values.Methods 351 positive serum of HBsAg,anti?HBe,anti?HBc of hepatitis B and 30 healthy man wrer collected.Pre?S1 antigen and HBV markets were detected with ELISA and HBV?DNA with fluorescent quantitative PCR(FQ?PCR) respectively.Results The positive rates of HBV?DNA and Pre?S1 antigen were 62.7%(4.5×106 copies／ml)、72.9% respective in patients with hepatitis B of which HBsAg、anti?HBe、anti?HBc were positive.Conclusion There were replication of virus in patients with HBeAg negative,The serum levels of HBV?DNA of patients with hepatitis B closely correlate Pre?S1.HBV?DNA with fluorescent quantitative PCR for the patients with hepatitis B is helpful to clinical diagnosis、clinical evalution and prognosis.

　　Key words：Hepatitis B；HBV?DNA；Pre?S1 antigen

　　乙型肝炎血清标志物的检测方法有多种，寻求快速、敏感和特异性检测手段具有十分重要的意义。前S1(Pre?S1)抗原已成为HBV感染、复制和乙肝患者诊断、和预后的一个重要标志，但存在“窗口期”及“免疫逃避株”等问题。乙型肝炎病毒HBV?DNA含量是判断病毒复制活跃和具有传染性的直接可靠依据，HBV?DNA定量测定可以反映乙型肝炎病毒(HBV)的量的变化，直接检测患者血清中病毒的拷贝数量，反映患者病毒血症的水平。本研究观察了乙肝小三阳患者血清标志物、前S1和HBV?DNA三者之间的相关性，探讨了HBV?DNA检测的临床意义,现报道如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  标本  收集我院351例乙型肝炎小三阳患者血清,其中男273例，平均年龄30.1岁，女78例，平均年龄32.3岁，健康对照30例,男25例，平均年龄33.8岁，女5例，平均年龄34.6岁。留取清晨空腹静脉血，分离血清，-20 ℃保存待检。

　　1.2  仪器  RSP150/8全自动加样器(瑞士TECAN公司生产)，BEPⅢ全自动酶免疫分析仪(德国DadeBehring公司生产)，美国ABI公司AB770型PCR荧光定量仪。

　　1.3  方法

　　1.3.1  血清标志物(HBsAg、抗?HBs、HBeAg、抗?HBe、抗?HBc)检测  应用ELISA方法，试剂由上海实业科华生物技术有限公司提供，试剂批号分别为：20060718、20061013、20060913、20060925、20060924。用瑞士TECAN公司生产的加样器(RSP150/全自动酶免分析仪)进行加样(包括质控血清、阴阳性对照及待检血清)，然后用BEPⅢ全自动酶免疫分析仪进行检测，判定方法严格按照说明书进行。

　　1.3.2  前S1抗原检测  采用双抗体夹心ELISA法，用抗?前S1和抗?HBs作为固相化抗体和酶标抗体，单抗捕获待检标本中的乙肝病毒表面抗原，用辣根过氧化物酶标记的抗Pre?S1单抗作为检测抗体。严格按照试剂盒说明书的检测步骤进行操作，根据酶?底物反应后的呈色吸光值，测定血清中乙肝病毒Pre?S1，试剂由上海阿尔法生物技术有限公司提供，试剂批号：20060601。

　　1.3.3  HBV?DNA定量测定  采用PCR方法结合荧光探针体外扩增和检测技术，试剂由深圳匹基生物工程股份有限公司，该试剂盒的检测下限为5.0×108 copies／ml，试剂批号：20060301。

　　1.4  统计分析计数资料  采用配对计数资料卡方检验，所有数据用SPSS 11.5处理。

　　2  结果

　　2.1  HBsAg、抗HBe、抗?HBc阳性组(小三阳组)  HBV?DNA检出率为62.7%,其HBV?DNA平均含量为4.5×106 copies／ml；前S1抗原检出率为72.9％。可见部分HBeAg转阴患者仍存在病毒高复制。30例健康对照者血清HBV标志物、HBV?DNA及前S1均为阴性，结果见表1。

　　表1  351例乙肝小三阳患者血清HBV?DNA及前S1抗原检测结果(略)

　　2.2  乙型肝炎小三阳患者Pre?S1与HBV?DNA的关系  351例乙型肝炎小三阳患者血清中，HBV?DNA阳性为220例，Pre?S1阳性为256例，其阳性检出率分别为62.7%(220／351)、72.9%(256／351)。HBV?DNA阳性组中Pre?S1检出率为77.3%(170/220)，HBV?DNA阴性组中Pre?S1检出率为65.6%(86/131)，Pre?S1与HBV?DNA检出率不一致，HBV?DNA与Pre?S1检出率差异有统计学意义(χ2=18.4，P<0.05)，见表2。

　　表2  乙型肝炎小三阳患者血清Pre?S1与HBV?DNA的关系(略)

　　3  讨论

　　HBV血清标志物检测是目前诊断乙肝最常用的指标，它主要反映人体对乙肝病毒的免疫反应状态，不能直接反映HBV在患者体内的复制情况。由于HBV血清标志物复杂多样，临床上难以根据这些结果对HBV感染复制情况进行准确判断。HBV的外衣壳蛋白包括S蛋白、前S1蛋白和前S2蛋白，研究显示，前S1蛋白含有肝细胞膜受体，与病毒侵入肝细胞以及HBV复制关系密切［1］。Pre?S1作为病毒复制的标志物之一被广泛应用于临床。ELISA抗原检测方法一般需要1015～1017个病原体才可检测出阳性，而病毒感染后“窗口期”则会出现假阴性结果。荧光定量PCR技术的出现，解决了病原体感染后的发病时间、病情轻重与病原体数量的关系［2］。探讨HBV血清标志物、前S1、HBV?DNA检测及其相互间的关系对于乙型肝炎临床诊断、疗效观察和预后判断具有重要意义。本研究采用ELISA及FQ?PCR方法检测351例乙型肝炎小三阳患者血清标本的前S1、HBV?DNA，结果显示小三阳患者血清中HBV?DNA检出率达62.7%。HBV?DNA平均含量为9.5×105 copies／ml；Pre?S1检出率为72.9%。通常认为HBeAg阳性是HBV复制活跃的指标之一，本研究结果表明HBeAg阴性并不表明HBV复制的完全终止或病毒血症的消失，该结果和Pichoud等［3］的报道基本一致，病毒拷贝数与HBeAg阳性相比明显下降，表明在HBV感染者体内HBeAg向抗?HBe血清转换的动态过程中，病毒的复制逐渐减少。前S1与HBV?DNA检出率并不一致，可能是前S1和HBV?DNA检测所表达的意义并不完全一致，慢性乙型肝炎病程早期(HBsAg阳性)，HBV?DNA阳性而Pre?S1阴性；病程后期，部分病例Pre?S1阳性而HBV?DNA为阴性。因此，不能仅依照Pre?S1来判断病毒是否复制，Pre?S1不能完全代替HBV?DNA的检测，只能作为其补充的指标。传统观念认为慢性乙肝患者出现HBeAg转阴或转为HBeAb阳性后传染性小，病情好转，常作为抗病毒有效的指标。本研究表明，HBeAg阴性乙肝小三阳患者血清采用敏感的DNA信号扩增法约40%可检出病毒活动性复制，其中约70%为HBV前C/C区变异的突变株［4，5］，而对于HBeAg阴性慢性乙肝患者，是否存在HBV?DNA复制是判断病情与预后、衡量抗病毒疗效的关键指标。有研究认为前S1抗原与HBV复制有更密切关系，Pre?S1作为病毒复制的重要指标，较HBeAg敏感。在本研究中，Pre?S1与HBV?DNA高度相关，表明Pre?S1与HBV的复制具有一致性，但HBV?DNA阳性组中Pre?S1检出率为77.3%，和HBV?DNA的检出率差异有显著性，因此认为临床上判断病毒的复制及其活跃程度不能单靠HBeAg或Pre?S1是否阳性，准确的方法是荧光定量PCR方法对HBV?DNA进行定量检测。血清中HBV?DNA的量是反映病毒复制的最直接标志，是评价传染性的最可靠的方法，荧光定量PCR技术能从DNA水平鉴别其潜伏性和活动性，可以作为HBV感染的分子诊断标准因此对于乙型肝炎病毒感染者，在常规血清学标志物检测的基础上，采用FQ?PCR方法对HBV?DNA数量进行动态观测，对乙型肝炎的诊断、抗病毒治疗的药物疗效评价、指导乙型肝炎合理治疗方案的制订以及预后判断有非常重要的意义。

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　　［1］  卢建华，宋晨朝，郎振为，等．前S1蛋白检测在慢性乙型肝炎患者病理诊断中的价值［J］．中华传染病杂志，2006，24(1)：60?62.

　　［2］  姚磊，潘海龙，张征，等．59 434例就诊者血清乙肝病毒标志物的检出与分析［J］．重庆医学，2003，32(4)：469.

　　［3］  Pichoud C,Berby F,Stuyver L,et al.Persistence of viral replication after anti?Hb seroconversion during antiviral therapy for chronic hepatitis［J］.B J Hepatol,2003,32:307.

　　［4］  Ikeda K,Arase Y,Saitoh S,et al.Long?term outcome of HBV carriers  with negative HBe antigen and normal aminotransferase［J］.Am J Med.2006，119(11):977?985.

　　［5］  Kidd?Ljunggren K,Holmberg A,Blackberg J,et al.High levels of hepatitis B virus DNA in body fluids from chronic carriers［J］.J Hosp Infect.2006，64(4):352?357.