厄贝沙坦对糖尿病大鼠肾脏MMP-2/TIMP-2基因表达的影响
来源：岁月联盟
时间：2010-07-12
【关键词】 厄贝沙坦 基质金属蛋白酶-2 组织金属蛋白酶抑制因子-2 糖尿病肾病
Effects of irbesartan on expression of matrix metalloproteinase-2/tissue
【Abstract】 Objective To observe the effects of irbesartan on expression of matrix metalloproteinase-2/tissue inhibitor of metalloproteinase -2 in streptozotocin induced diabetic rats. Methods Male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into three groups： normal control rats (group N，n=8)， diabetic rats (group DN，n=9) and diabetic rats treated with Irb (group DNI，n=10). Diabetes was induced by injection of STZ intraperitoneally after rats had received uninephroectomy. Renal expression of MMP-2 and TIMP-2 was determined by RT-PCR when all rats were sacrificed at week 8.Results Semi-quantitative assessment of RT-PCR showed that glomerular expression of MMP-2 and TIMP-2 in group DN was significantly increased as compared to that in group N and much lower in group DNI compared to that in group DN.While the ratio of MMP-2/ TIMP-2 was lower in group DN and higher in group DNI.Conclusion The changes of the expression of MMP-2 and TIMP-2 might play a pathogenetic role in diabetic nephropathy. Irb exerted renal protective role to early diabetic nephropathy， possibly through correction the balance of MMP-2/ TIMP-2 which benefited to reduce accumulation of extracelluar matrix(ECM).
【Key words】 irbesartan matrix metalloproteinase-2 tissue inhibitor of metalloproteinase-2 diabetic nephropathy
糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的主要并发症和死亡原因之一，为提高糖尿病患者的生活质量及生存率，使得早期防治糖尿病肾病尤为重要。本研究用RT-PCR方法了解基质金属蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和组织金属蛋白酶抑制因子-2（Tissue inhibitor of metalloproteinase-2 ，TIMP-2）在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠肾组织中的表达情况，并探讨新一代的血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（angiotensinII receptor antagonist，AIIRA）厄贝沙坦(irbesartan，Irb)对糖尿病大鼠尿白蛋白排泄、早期肾肥大的改变以及肾脏MMP-2和TIMP-2表达的影响，以阐明其肾保护作用机制，为DN的预防和治疗提供实验理论依据。
1 材料与方法
1.1 糖尿病模型建立和分组 选择SPF级成年雄性SD大鼠，购自院上海实验动物中心［许可证号：SCXK(沪)2002-0010］，体重(180±20)g。大鼠右肾切除2周后一次性腹腔注射STZ(Sigma公司， 50mg/kg)诱导糖尿病模型。48h后测血糖，以随机血糖＞16.7mmol/L且尿糖强阳性作为糖尿病动物模型建立标准，未达到标准者均淘汰。血糖稳定1周后随机分为糖尿病肾病（DN）组（n=9）和厄贝沙坦治疗组（DNI， Irb 50mg/kg灌胃）（n=10）。另设8只大鼠为正常对照（N）组（n=8），给予等量枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液腹腔注射。N组及DN组仅予等量自来水灌胃。实验期间血糖保持在20mmol/L左右。
1.2 一般观察指标和测定方法
1.2.1 生化指标 外周血血糖用微量血糖仪检测；血生化指标及尿肌酐用自动生化分析仪检测；CCr按公式：尿肌酐浓度（mg/ml）×每分尿量（ml）/血肌酐浓度（mg/ml），并用体重校正。
1.2.2 尿白蛋白测定 采用液相免疫沉淀方法。
1.3 病理组织切片染色 采用H.E染色。
1.4 RT-PCR (1)肾组织总RNA的提取；(2)测定RNA浓度、纯度和完整性；(3)引物：MMP-2：5′ GGTTTATTTGGCGGAC 3′；5′ TCAGCAGCCCAGCCAGTC 3′［1］512bp；TIMP-2：5′GGCAAGATGCACATTACC 3′；5′TTGACATCCCTTCCTGGA 3′［2］386bp；β-actin：5′ GATGGTGGGTATGGGTCAGAAGGA 3′；5′ GCTCATTGCCGATAGTGATGACCT 3′［3］632bp；(4)在PCR仪中42℃ 60min，99℃ 5min进行逆转录；(5)扩增：95℃ 7min×1 cycle；95℃ 55sec Tm 56sec 72℃ 1min×36 cycles；72℃ 10min×1 cycle；6 以1.7%的琼脂糖凝胶电泳PCR产物，电压100mV，约40min用Image Master VDS扫描分析仪扫描凝胶图谱。用Total Lab分析软件对PCR条带进行密度扫描分析，目的片段和β-actin的比值作为实验数据。
1.5 统计学方法 所有数据均以x±s表示，采用Prism 3.0统计软件，组间比较采用方差分析或t检验和U检验。P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 各组大鼠血糖、体重变化 由表1可知，腹腔注射STZ后，糖尿病大鼠血糖明显上升，体重明显减轻。但是DN组与DNI组大鼠血糖无差异（P＞0.05）。
2.2 各组大鼠CCr、24hUalb的改变 由表2可见，8周时DN组CCr较N组明显升高（P＜0.01），而DNI组CCr较DN组明显下降（P＜0.01），但未恢复至正常水平。DN组大鼠24hUalb 8周时与N组相比明显升高（P＜0.01），DNI组与DN组同期相比，24hUalb明显减少（P＜0.01），但与N组相比仍增高(P＜0.01)。
2.3 各组大鼠肾脏肥大指标的改变 如表1所示，8周时DN组肾重、肾脏肥大指数（肾重/体重×1000）较N组明显增加（P＜0.01），DNI组肾重、肾脏肥大指数（肾重/体重×1000）较DN组显著减少(P＜0.05或P＜0.01)，提示肾脏肥大明显受抑制，但与N组比较仍差异有非常显著性(P＜0.01)。
2.4 肾组织病改变和定量分析 8周后，正常大鼠肾小球和肾小管间质未见明显的病理改变。糖尿病大鼠肾组织可见肾小球体积明显增大，系膜区增宽，但未见明显的肾小球硬化。病理定量分析结果表明（表1），至8周时DN组肾小球面积和体积较N组明显增加（均为P＜0.01），DNI组与DN组比较明显减小（均为P＜0.01）。
2.5 肾组织MMP-2和TIMP-2的表达及半定量结果比较 MMP-2和TIMP-2在N组大鼠有微弱表达，DN组大鼠二者的表达较N组明显增加（均为P＜0.01），经Irb治疗后的DNI组二者的表达较DN组明显减弱（均为P＜0.05）（图1）。但MMP-2/TIMP-2的比值在DN组减少，DNI组升高（均为P＜0.05）（见表3）。
图1 8周各组大鼠MMP-2/TIMP-2 RT-PCR结果：N组大鼠有微弱表达，DN组大鼠二者的表达较N组明显增加，经Irb治疗后的DNI组二者的表达较DN组明显减弱。N：正常组；DN：糖尿病组；DNI：Irb治疗组
表1 8周后各组大鼠血糖、体重及肾脏肥大的比较 （x±s）
注：**P＜0.01与正常组比较；##P＜0.01，#P＜0.05与糖尿病组比较。N：正常组；DN：糖尿病组；DNI：Irb治疗组
表2 8周后各组大鼠肾功能比较 （x±s）
注：**P＜0.01与正常组比较；##P＜0.01与糖尿病组比较。N：正常组；DN：糖尿病组；DNI：Irb组
表3 8周后各组大鼠肾组织MMP-2和TIMP-2mRNA表达及MMP-2/TIMP-2比值的比较 （x±s）
注：**P＜0.01，*P＜0.05与正常组比较；#P＜0.05与糖尿病组比较。N：正常组；DN：糖尿病组；DNI：Irb治疗组
3 讨论
ECM的过度积聚是肾小球硬化的前奏。ECM是由合成和降解两个代谢过程调节的，两者之间的平衡决定了ECM的积聚和纤维化的进程。ECM合成增加和（或）降解减少，将引起ECM过度积聚，导致器官纤维化。ECM降解蛋白酶主要有两个系统：纤溶酶原激活物（PA）/纤溶酶系统和基质金属蛋白酶系统（MMPs），PA活性受纤溶酶原激活物抑制物PAIs的抑制，金属蛋白酶组织抑制物TIMPs可抑制MMPs的活性［4］。MMPs是一类含有Zn2+，活性依赖Ca2+的结构高度同源的内肽酶的总称，是目前认为最重要的一类降解ECM的蛋白酶类，几乎能降解全部ECM成分。
在本研究中，RT-PCR结果提示8周糖尿病大鼠肾组织MMP-2和TIMP-2 mRNA表达上调，但MMP-2/TIMP-2的比值却是下降的，这可能导致MMP-2活性下降，ECM降解减少，从而促进DN的发生、发展。Mclennan、Wahab和Mason等发现高糖可以使人系膜细胞MMP-2表达增加而MMP-9、MMP-7表达减少，TIMP-1表达增加［5～7］。同样在STZ诱导的糖尿病大鼠肾组织中Mclennan等测定MMP-2 mRNA表达是增高的，而其活性却下降了49%［8］。Wang等人研究发现高糖可以增加小鼠系膜细胞MMP-2 mRNA和活性（仅培养24h）［9］。Reckelhoff等人发现STZ诱导的糖尿病大鼠肾小球MMP活性在糖尿病早期下降75%，在此后的慢性阶段亦持续下降40%～50%。Caenazzo等人在人和小鼠系膜细胞培养中发现高糖可以使MMP-2和TIMP-2mRNA合成减少，而MMP-2/TIMP-2比值降低，使MMP-2活性下降，ECM降解减少，从而有利于ECM沉积，系膜基质扩张［10］。虽然由于各种原因可能导致了不同的实验结果，但是更多的研究，包括本研究提示MMP-2/TIMP-2比例失衡，MMP-2活性下降在DN的发生、发展中起重要作用。
肾脏局部RAS系统的异常可能在DN的发生发展中具有重要作用。AngⅡ是该系统的效应分子。肾脏局部AngⅡ的浓度比血浆中高出1000倍，局部的AngⅡ除可引起血流动力学改变外，尚可直接调控多种血管活性因子、细胞因子、生长因子以及炎症细胞的作用，如ET-1、TGFβ、bFGF、PDGF、TNFα、OPN、VCAM-1、NF-κB等，从而影响肾细胞的生长和基质代谢［11～13］，是一种生长因子和促纤维化因子。AngⅡ与特异性受体结合后发挥生理作用。AngⅡ受体主要有AT1、AT2、AT3、AT4四种亚型［14］，AT1受体在肾脏表达尤为丰富，机械牵拉能促进表达，AngⅡ参与肾损害的作用主要与此型受体有关。大量临床试验如IRMA-2、RENAAL、IDNT等均已证实Irb可以降低2型糖尿病患者尿蛋白的排泄，延缓肾病进展，使透析或行肾移植时限平均延迟2年［15］。但其确切机制尚不明确。我们的研究亦发现Irb能够降低糖尿病大鼠早期尿白蛋白排泄，降低过高的CCr，改善肾小球的高滤过；同时经Irb治疗的糖尿病大鼠肾脏肥大指数、肾小球面积、体积较糖尿病大鼠明显减小，说明Irb可以抑制早期肾脏肥大；DNI组大鼠MMP-2/TIMP-2的比值升高，达到正常对照组水平，提示Irb可以纠正MMP-2/TIMP-2比例失衡，提高MMP-2活性，加强ECM降解，从而实现肾脏保护功能。
本实验从肾脏ECM降解方面阐述了早期DN的发病机制；证实了Irb，一种新型AⅡRA的肾脏保护作用，并且这种保护作用与MMP-2/TIMP-2密切相关，为DN的早期预防和治疗提供重要理论依据。
【】
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