钙离子对体外培养皮肤角质形成细胞增殖与分化的调控作用

         作者：章培标，侯宜，侯立中，曲福军，周余来，颜炜群，杨同书

【摘要】  目的  观察无血清培养中不同钙离子浓度对皮肤角质形成细胞(Kc)增殖与分化的影响，为角质形成细胞的体外扩增和人工表皮形成提供依据。方法  取第二代新生兔背皮肤角质形成细胞，按0.5×104/cm2细胞密度接种于含不同浓度CaCl2角质形成细胞培养液的96孔板中，培养1周，每日观察细胞生长情况，至第7日以MTT法检测OD值。结果  当CaCl2浓度低于5mg/L时，细胞贴壁增殖缓慢，甚至无法贴壁；浓度为12.5mg/L 时Kc呈单层快速生长，并能保持较好的表型，是体外Kc培养扩增的最适钙离子浓度；当CaCl2的浓度达到25mg/L时，Kc形成复层，集落中央出现大量分化程度较高的角化细胞和角化物，周边仍存在增殖能力较强的单层Kc，逐渐向四周扩展。随着Ca2＋浓度的增高，细胞角化程度也随之增高。结论  Ca2+浓度对体外培养的Kc贴壁、增殖、分化等不同阶段产生影响，通过控制无血清培养液中Ca2+浓度可以调控Kc的增殖和分化。

    【关键词】  钙离子  角质形成细胞  分化  人工皮肤  组织工程

     Calcium is one of the key factors adjusting proliferation and differentiation of epidermal keratinocytes cultured in vitro

        【Abstract】  Objective  To explore the effects of calcium at different levels on proliferation and differentiation of epidermal keratinocytes cultured in serum free medium in vitro'  which is the base of tissue engineering skin.
Methods   Second passage epidermal keratinocytes of neonatal rabbits were seeded into 96-poles plate according to the cell density of 0.5×104/cm2'and cultured with serum free medium contained different levels of CaCl2 for 1 week.The cultured keratinocytes were observed' and identified with immunohistochemical test. Then' MTT test was used to detect the relative growth ratios(RGR) of keratinocytes cultured in K-SFM with different levels of
calcium.Results  The results showed that keratinocytes grown slowly in K-SFM at the level of 5mg/L CaCl2.As the concentration of CaCl2 was 12.5mg/L' keratinocytes grown rapidly in mono-layer keeping its well phenotype. When it grown up to the level of 25mg/L'  keratinocytes became stratum and differentiated apparently.Conclusion  It is   suggested that calcium is one of important factors to decide the growth' differentiation of epidermalkeratinocytes. Two suitable concentrations of calcium could be used to culture keratinocytes and artificial epidermis of tissue engineering in vitro respectively.

    【Key words】  calcium  keratinocyte  serum free culture  artificial skin  tissue engineering

    1  材料与方法

    1.1  试剂  K-SFM(GIBCO，不含钙，其完全培养液按说明书添加CaCl2)，大豆胰酶抑制剂(SIGMA)，CaCl2(分析纯，国产)，硫酸链霉素（SIGMA），角蛋白免疫组化试剂盒（武汉博士德公司），MTT（SIGMA），DMSO（AMRESCO），胰蛋白酶(HYCLONE)，中性蛋白酶（SIGMA）。

    1.2  设备器材  超净工作台(国产)，二氧化碳培养箱(SANYO)，倒置生物显微镜(OLYMPUS)，酶联免疫检测仪（国产），塑料培养板（皿）（Nunc）。

    1.3  实验动物  日本大耳白兔，来自长春208动物部。

    1.4  实验方法

    1.4.1  Kc的分离培养  取新生兔背部皮肤，Kc的分离、培养和传代方法及角蛋白(广谱)ABC免疫组化鉴定按［1］进行。

    1.4.2  Ca2+浓度对Kc增殖分化的影响  (1)取第二代Kc，D-Hank’s离心洗3次后，以不含Ca2+的K-SFM制成细胞悬液，按0.5×104细胞数/孔接种于96孔板，同时添加20μl不同浓度CaCl2，CaCl2终浓度分别为0、2.5、5、12.5、25、50、100、200、400mg/L，均在36℃ 5%CO2条件下培养1周，每日观察细胞生长情况，1周时以MTT法检测OD值。(2)取第二代Kc'按1×104细胞数/孔接种于6孔板内盖玻片上，以含12.5mg/L CaCl2的K-SFM培养1周后，实验组更换为25.0mg/L CaCl2的K-SFM继续培养，待Kc形成复层后再换成无钙K-SFM进行培养，观察Kc的生长情况及形态变化并做角蛋白(广谱)ABC免疫组化染色分析。

    2  结果与讨论

    无血清培养液中Ca2＋的浓度对Kc的生长分化极为重要。培养液中Ca2+浓度可影响Kc的增殖分化，其浓度不同，Kc生长状态也不同［2］。在低Ca2+浓度（0.1mM）条件下，培养的Kc可不形成细胞间连接而迅速扩增，而通过增加胞外Ca2+浓度（1.2～2.0mM），可诱导发生多种变化，包括形成复层、桥粒和黏着连接［3，4］。钙是细胞分化过程的一个首要条件，尤其是复层及桥粒的形成和聚集。同时，也是鳞状细胞分化中表皮谷氨酰胺转移酶激活的前提。低浓度Ca2+（0.05～0.1mM）下，体外培养的人Kc不能集聚桥粒，也不能出现复层，即使退出细胞周期并且仍然合成外皮蛋白和桥粒蛋白［5］。通过增加钙浓度到生理水平（1.2mM），Kc在24h内即可形成复层［6，7］。因此，可以通过控制Ca2＋浓度实现控制Kc的增殖与分化。

    体外成功构建组织工程人工皮肤，首先需要获得大量的具有增殖能力的Kc。因此，Kc的培养阶段应尽可能保持细胞表型，延缓其分化。传统的含血清培养方法，通常在合成培养基中添加10%～20%的胎牛血清，而血清中的Ca2+含量足可以加速Kc分化，减少传代次数［1］。无血清培养方法其营养组分稳定、清晰可控，通过在无钙的K-SFM中根据需要添加不同浓度的CaCl2可以实现调控Kc的增殖与分化。

    本研究结果表明，Ca2+浓度可对体外培养的Kc贴壁、增殖、分化等不同阶段产生影响。当CaCl2浓度低于5mg/L时，细胞贴壁增殖缓慢，甚至无法贴壁。12.5mg/L CaCl2即可保证细胞的生长增殖，在此浓度下Kc呈单层生长，能较好地保持表型，是体外Kc培养扩增的最适钙离子浓度。当Ca2＋的浓度为25mg/L时，Kc形成复层，集落中央出现大量分化程度较高的角化细胞和角化物，但周边仍存在增殖能力较强的单层Kc，逐渐向四周扩展。同时，随着Ca2＋的浓度增高，细胞角化程度也随之增高，见图1～5。形成复层的Kc，换成无钙的K-SFM后2天，上层角化细胞脱落，转变为单层生长。报道［8］，完全融合后的正常Kc和转化Kc以K-SFM继续培养，细胞不能持续生长，不能形成复层细胞结构，也无法形成Kc膜片。通过在K-SFM中添加1.8mmol/L Ca2+可发生进一步的细胞分化、形成复层和完整的Kc膜片。提示无血清培养液中选择合适的钙离子浓度对体外Kc的扩增和组织工程人工皮肤的构建具有重要意义。

                                    

                                                    图2  含12.5/L CaCl2的培养1周的Kc (×100)
                                                   图3  加双倍钙离子浓度的K-SFM培养1周的Kc，集落中央Kc形成复层，
                                                   角化程度明显增高，细胞界限不清(×100)
                                     
 
                                            
                      
                              图4  双倍钙离子浓度下K-SFM培养1周，集落周边的仍丰在单层Kc，增殖能力较强，向四周扩展
                                                                                     (×200)
                              图5  角蛋白（文谱）ABC免疫组化染色显示无血清培养的不同分化程度的Kc (×100)
 
                                                                            【文献】

    1  章培标，侯立中，侯宜.皮肤角质形成细胞的无血清培养方法.黑龙江医药，2003'16（5）：442.
    2  Boyce ST' Ham RG.Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology'1983'81:33-40.
    3  Leto TL'Pratt BM' Madri JA. Mechanisms of cytoskeletal regulation: modulation of aortic endothelial cell protein band 4.1 by the extracellular matrix.J Cell Physiol'1986'127:423-443.
    4  O’Keefe EJ' Briggaman RA' Herman B. Calcium induced assembly of adherence junctions in keratinocytes. J Call Biol'1987'105: 807-817.
    5  Leigh IM'Watt FM.The Keratinocyte Handbook.Cambridge：Cambridge University Press'1994，43-52.
    6  Fuchs E.Epidermal differentiation: the bare essentials. Journal of Cell Biology'1990'111:2807-2814.
    7  Hennings H' Michael D' Cheng C'et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.Cell' 1980' 19:245-254.
    8  苏映军'陈璧'贾赤宇，等.体外长期培养人转化角朊细胞系的生物学特征.第四军医大学学报，