26蜂毒肽与IL-2嵌合蛋白对体外培养的HeLa细胞生长的影响
【关键词】 26蜂毒肽-IL-2嵌合蛋白 HeLa细胞 MTT
Fusion protein of 26-peptide-melittin and interleukin-2 influenced the growth of HeLa cell in vitro
【Abstract】 Objective To investigate the influence of fusion protein of 26-peptide-melittin and interleukin-2 on the growth of human cervical cancer cell in vitro.Methods The anti-tumor activity of the fusion protein of melittin and interleukin-2 was detected by MTT method， and its influence on the morphology of HeLa cell was observed too. Results The fusion protein had inhibitory effect on HeLa cell， and the inhibitory rate was relevant to its concentration. After incubation for 24～48h，the cells showed evident morphologic changes in optic microscope.Conclusion The fusion protein of melittin and interleukin-2 could inhibit the proliferation of HeLa cell.
【Key words】 fusion protein of 26-peptide-melittin and interleukin-2 HeLa cell MTT
蜂毒溶血肽(melittin) 是蜂毒的主要组分，具有免疫调节作用，通过增强Th1淋巴细胞功能，降低Th2淋巴细胞功能，达到抗过敏、抗炎症、抗肿瘤等效果［1］，体外试验， 蜂毒肽对淋巴瘤、肉瘤有细胞毒作用，对Rous 肉瘤和HeLa 细胞(宫颈癌细胞) 均有抑制作用，其作用机制是蜂毒素使细胞微粒体膜溶解， 抑制其呼吸， 从而抑制肿瘤组织生长［ 2 ］。但大剂量蜂毒素毒性较明显。白细胞介素-2（IL-2）是由体内活化的T细胞分泌的，具有多种与免疫功能强化有关的生物学活性［3，4］。其制剂已用于治疗肿瘤、免疫缺陷和感染性疾病并取得了显著的效果。但IL-2制剂在临床使用过程中，显示出抗肿瘤的活性不够特异，另外也伴随着对正常细胞的毒性。蜂毒素、IL-2单独使用时产生的副作用限制了它们在临床的广泛应用。因此增加疗效、减少副作用是人们所期待的，为了达到减毒增效之目的， 本实验室利用基因工程技术获得了重组嵌合蛋白，在此基础上本文研究了26肽蜂毒素- IL-2嵌合蛋白对体外培养的HeLa细胞生长的影响，现报告如下。
1 材料与方法
1．1 药品和试剂 RPMI-1640干粉培养基，美国GIBCO公司产品；胰酶，AMERSCO公司产品；新生牛血清，杭州四季青产品；四甲基偶氮唑蓝（MTT），Sigma 公司产品； 96孔培养板，Coster公司产品；嵌合蛋白，本室构建。
1．2 细胞株 HeLa细胞株购自山东省医学院药物研究所，RPMI-1640基础培养液中加入10%新生牛血清，1×105U/L青霉素，100g/L链霉素，置37℃ 5%CO2孵箱中培养，3～4天传代1次。人成纤维细胞本室保存，传代培养同HeLa细胞。
1．3 仪器和设备 酶联免疫检测仪系BIO-RAD公司产品，CO2孵箱系美国SHELLAB公司产品，倒置显微镜系公司产品（OLYMPUS），分析天平（Sartorius），低温高速离心机系德国Heracus公司产品。
1．4 细胞增殖试验 取对数生长期的HeLa细胞，胰酶消化后10%的小牛血清的RPMI-1640培养液稀释细胞，制成5×105/L细胞悬液，加入96孔培养板中，每孔200μl ， 置37℃，5%CO2孵箱中培养12～24h后分别加入2.5，5.0，10，20，40mg/L不同稀释度的嵌合蛋白，并以阿霉素（20mg/L）作阳性对照，生理盐水作阴性对照。同时以正常人二倍体成纤维细胞作细胞对照。每个浓度设6个复孔，置37℃，5%CO2孵箱中继续培养72h， 培养结束前4h，每孔加入MTT 20μl，37℃培养箱中培养4h，离心弃上清后每孔加二甲基亚砜200μl，微量振荡器振荡5min，自动酶标读数仪比色(波长570nm)，测吸光度并嵌合蛋白对HeLa细胞的抑制率，求IC50。HeLa细胞抑制率=1-（实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100%。
1．5 光镜形态学观察 细胞接种在放有盖玻片的 6 孔培养板中培养，待细胞生长至对数生长期，加入不同稀释度的嵌合蛋白，继续培养，定时镜下观察。
1.6 统计学方法 每份样本平行测定 6 孔，数据均以x±s表示。
2 结果
2.1 嵌合蛋白对HeLa细胞生长的抑制作用 作用 3 天后高浓度组较低浓度组对细胞的抑制作用增强，细胞抑制率见表1，各浓度组嵌合蛋白对人二倍体成纤维细胞均无明显影响。
表1 嵌合蛋白对HeLa细胞增殖抑制率的影响
2.2 倒置显微镜观察 阴性对照组HeLa细胞生长良好，细胞伸展，呈不规则多角形。实验组培养24h后
HeLa细胞数目减少，随着时间的推移，细胞明显皱缩，浆内出现空泡，胞内颗粒增多，培养液中有许多漂浮的
呈桑叶状细胞，72h后上述改变更为明显。
3 讨论
本实验选用通用癌细胞株HeLa细胞，并以正常人二倍体成纤维细胞作对照，应用MTT法研究了嵌合蛋白对HeLa细胞生长的影响。实验结果表明，嵌合蛋白对HeLa细胞的生长有抑制作用，10mg/L的嵌合蛋白对HeLa细胞有明显的抑制作用，且随浓度及时间的增加抑制作用增强。同样条件下嵌合蛋白对正常人二倍体成纤维细胞的影响不明显。光镜观察结果显示嵌合蛋白作用24h后细胞出现形态学改变且随时间的增加更为明显。
分子生物学研究表明，蜂毒肽具有膜活性特点，与膜作用时，随着时间的变化， 四聚体衰变为稳定的三聚体和单体。这个持续的构型变化将伴随着含水孔的横向扩张，主要由α-螺旋之间的静电排斥造成孔增加，因此细胞裂解［5］。蜂毒肽具有对肿瘤细胞的选择性杀灭作用，又具有相对分子量小、热稳定性、无免疫原性等特点。IL-2是TC的淋巴因子，它能够增强LAK及NK细胞肿瘤杀伤活性［6，7］，具有高效的抗肿瘤作用。嵌合蛋白没有破坏IL-2的重要决定簇，同时降低了蜂毒肽的毒性，嵌合蛋白能协同IL-2与蜂毒肽增强细胞免疫的作用，能特异并高效激活CTL对肿瘤细胞的杀伤。它基本保留了抗肿瘤效应，同时减轻了蜂毒素、IL-2对正常细胞的毒性，这种独特的双重作用有利于肿瘤病人的综合和康复。嵌合蛋白作为一种高效、低毒的抗肿瘤药物，其确切的作用机制有待于进一步深入研究。
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1 Marek J ， Werner J P ， Dejan S ， et al. Bee venom immunotherapy results in decrease of IL24 and increase of IFN2 γ seccretion in specific allergen stimulated T cell cultures. J Immunology ， 1995 ， 4178 :154.
2 Lowy PH，M Itchell HK， T Racy UW. Bee venom phospholipase A 2; effects on drosophila larval， HeLa cells and membranes. Toxicin， 1976， 14 (3) : 2032212.
3 Henney CS，GallO K. Interleukin-2 augments natural killer cell activity. Nature， 1981，291:335-338.
4 Gillis S，Smith KA. Long term culture of tumor-specific cytotoxic T cells. Nature， 1977，268:154-156.
5 Yang S，Carrasquer G. 药报，1997 ，18(1) :3-5.
6 Aronson FR ，Libvby P ，Brandon EP， et al . IL - 2 rapidly induces natural killer cells adhesion to human endothelial cells. J Immunol ，1998 ，141 : 158-163.
7 Asano Y，Tada T. Generation of T cell repetition two distinct mechanisms for generation of T supressor cell T helper cells and T segmenting cells. J Immunol ，1998 ，142 :365 :373
