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内毒素对鼠肺/肠微血管及体外培养内皮细胞通透性的影响及凋亡在其中的作用

来源：岁月联盟作者：时间：2010-07-12

作者：贺志高1，肖南2 刘韧2，田昆仑2，刁有芳2，范小青

【摘要】目的 观察内毒素（LPS）对鼠肺和肠微血管及体外培养内皮细胞通透性的影响及凋亡在其中的可能作用。方法 (1)观察内毒素血症时大鼠肺、肠组织微血管通透性的改变。(2)观察LPS对体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）通透性的影响。(3)观察LPS对体外培养HUVEC凋亡的影响，从而探讨凋亡在内皮细胞通透性改变中的作用。结果 (1) 在大鼠内毒素血症模型中，5mg/kg和10mg/kg LPS均可造成肺、回肠组织伊文氏兰含量增加（P<0.01 或0.05）。(2)100μg/ml LPS可显著增加体外单层HUVEC对牛血清白蛋白的通透性（P<0.05或0.01）。(3)LPS可引起的体外培养内皮细胞的凋亡。结论 (1)LPS能迅速提高体内肺微血管内皮细胞通透性，而LPS作用后6h肠微血管通透性开始增加。(2)LPS可剂量依赖性的引起体外培养脐静脉内皮细胞通透性升高。(3)细胞凋亡可能是引起内毒素血症时内皮细胞通透性的原因之一。

    【关键词】 内皮细胞通透性；内毒素

    【Abstract】 Objective To observe the alteration of pulmonary and ileum microvascular permeability of rats and permeability alteration of monolayer endothelium in vitro following the administration of lipopolysaccharide， and the role of apoptosis in the altered permeability.Methods (1)To investigate the alteration of microvascular permeability of pulmonary and ileum in endotoxemia. (2)The effect of LPS on the permeability of human umbilicus vein endothelial cells (HUVECs) monolayer in vitro. (3)To observe the apoptosis of HUVECs following the administration of LPS. Results (1)The Evan’s blue content of pulmonary and ileum was increased after endotoxemia， but only the pulmonary reached significance(P<0.05 or 0.01). (2)When cocultured with HUVECs monolayer for 4h in vitro， LPS could dose-dependently increased leakage of FITC-BSA with significant effect at the dosage of LPS 100 μg/ml. Furthermore， LPS could induce endothelial apoptosis detected by acridine orange-ethidium bromide double stain and laser cofocal microscope.Conclusion (1)LPS significantly increased pulmonary microvascular permeability. (2)LPS could dose-dependently upregulate the permeability of monolayer endothelium in vitro.(3)LPS could result to the apoptosis of HUVECs in vitro and apoptosis might be one of the courses which result the upregulated endothelium permeability.

    【Key words】 endothelial permeability；lipopolysaccharide histamine

    内皮细胞通透性升高是炎性反应的重要特点，是微血管功能障碍的主要表现之一，可引起炎性动物的肺和脑等重要脏器水肿等严重后果，其调控机制十分复杂，其确切机制迄今尚未完全阐明。同时，LPS引起肠道屏障功能障碍，从而引起细菌移位及内源性感染，但肠微血管通透性改变在其中的作用尚不清楚。LPS在体内主要通过中性粒细胞等介导内皮细胞通透性上调，其对内皮细胞的直接作用尚存争议，近年来国内外研究表明，LPS引起的内皮细胞凋亡可能是内皮细胞通透性增加的原因之一。本实验首先研究内毒素血症时大鼠肺、肠微血管通透性的改变及LPS对体外培养HUVECs通透性的影响，并观察LPS对HUVECs的凋亡的影响。

    1 材料与方法

    1.1 试剂与器材

    1.1.1 动物实验 Wistar大鼠，内毒素(LPS， O111：B4， Sigma公司，美国)，伊文氏兰(Evan’s blue，国产)，甲酰胺(国产，分析纯)， 3%戊巴比妥钠，塑料三通管及导管，分光光度计(DU-7500，Beckman，美国)。

    1.1.2 HUVECs分离培养、鉴定采用7#线，血管钳，小号导尿管套于金属三通，30ml玻璃注射器，50ml烧杯，50ml透明刻度离心管，一次性75cm2培养瓶 (德国)， CO2恒温孵箱，方盘，离心机，手术巾。M199培养液，肝素，胶原酶(TypeⅠ，Worthington，美国)，endothelial cell growth supplements(ECGS， Sigma，美国)贮液， 2.0 %明胶(Sigma)，胎牛血清(FCS，Cyclone，美国)，PBS，Hepes，Glutamine，两性霉素B，青霉素，链霉素，胰蛋白酶，EDTA，Ⅷ因子抗体(兔抗人，北京中山)，二抗(鼠抗兔，博士德)，DAB染色试剂盒，乙醇。

    1.1.3 体外HUVECs通透性实验 Transwell Inserts(直径6.5mm，微孔径0.4μm， Costar，美国)， FITC-BSA (Sigma，美国) ，荧光检测仪 (美国)。其余培养试剂同2。

    1.1.4 内皮细胞凋亡/坏死检测 Acridine Orange/ ethidium bromide (AO/EB， Sigma，美国)，激光共聚焦显微镜(Leica LCS SP2，德国)，24孔细胞培养板，其余培养试剂同2。

    1.2 方法

    1.2.1 内毒素血症对大鼠肺、肠组织伊文氏兰含量的影响 Wistar大鼠 (n=66) ，体重200～250g，雌雄不拘，购自本院所动物实验室。动物随机分为3组：正常对照组、5mg/kg LPS组和10mg/kg LPS组。实验前大鼠禁食12～18h，不禁水。实验组经腹腔注射LPS，对照组以等量生理盐水代替，其余操作同实验组；笼养至相应时间点(2h、6h和12h)，经尾静脉以20mg/100g体重注射2%伊文氏兰1h后，3%戊巴比妥钠麻醉，右颈动脉和腹腔静脉插管，经颈动脉灌注预热至37℃的0.9%氯化钠溶液300ml直至冲出液清亮。切取全右肺、近回盲部回肠约1g，生理盐水冲洗净，滤纸蘸干，分别置于预先称重的试管中，90℃烘烤16h；碾碎称重，加入甲酰胺3ml，于50℃恒温水浴中密闭抽提24h。抽提液于612nm处测定OD值，根据标准曲线抽提液中伊文氏兰的含量，以伊文氏兰含量/每克干组织(μg/g)表示。结果以x±s表示，采用t检验进行统计学分析，P<0.05表示差异有显著性。

    1.2.2 HUVECs分离培养与鉴定参照加以改进［1］新鲜脐带取回后插三通管，扎紧，以细胞收集液冲洗至冲出液清亮。注入10～20ml预温至37℃的胶原酶溶液，置37℃孵箱内15～20min，用含20% FCS的M199培养液约30ml冲洗，收集，500g×5min离心。加入M199工作液重悬细胞，计数，将细胞接种于2%明胶包被的75cm2塑料培养瓶，37℃、5%CO2空气常规培养。采用0.05%胰酶-0.02%EDTA常规消化传代，细胞的鉴定采用Ⅷ因子抗原检测法、DAB染色阳性确定。

    1.2.3 体外内皮细胞通透性实验实验分组（N=54，n=9）：正常对照组，LPS组（终浓度1，10，100μg/ml）。采用3～5代细胞，实验时24孔细胞培养板中加入M199工作液600μl，用预先包被胶原的Transwell Inserts置于相应的孔内。每孔接种体积200μl(1.0×105个)，常规培养36h，镜下证实已融合致密时更换为加入处理因素的去ECGS培养液继续培养4h，在Transwell Inserts中加入FITC-BSA(2mg/ml)10μl，于15、30、45、60、90、120及180min后取下腔液体10μl，在荧光检测仪上测定(激发波长488 nm，发射波长525 nm)其荧光含量。各时间点的FITC-BSA透过量以下腔累计的示踪剂百分率(%)表示。各实验组以时间-示踪剂透过百分率作图，其斜率为示踪剂FITC-BSA透过单层内皮细胞进入下腔的速率(示踪剂透过量/min)。各组透过速率以x±s表示，采用t检验进行统计学分析。

    1.2.4 LPS对内皮细胞凋亡/坏死的影响实验分组及处理同前，待生长至80%融合时加入处理因素作用4h。用1×PBS轻轻洗涤细胞后加入AO-EB染色，作用30s后吸弃，用1×PBS洗涤。激光共聚焦显微镜（Leica LCS SP2，德国）下观察。

    2 结果

    2.1 内毒素血症对大鼠肺、肠组织伊文氏兰含量的影响（μg/g干组织）见图1、2。

2.2 LPS和组织胺对体单层HUVECs通透性的影响见图3。

2.3 LPS对内皮细胞凋亡/坏死的影响细胞经AO-EB染色，在激光共聚焦显微镜下观察，健康活细胞的胞核呈绿色网状结构，胞浆有红-橙色颗粒；凋亡细胞可见细胞收缩变圆，整个细胞呈均匀的绿色；坏死细胞则呈明亮的红色。结果显示，对照组细胞生长正常，无凋亡和坏死细胞出现（图4），而100μg/L LPS处理后凋亡细胞增多，并可出现坏死细胞（图5）。

图4 对照组细胞经AO-EB染色，可见细胞后，可见生长正常，无凋亡或坏死细胞。40×

图5 100μg/ml LPS处理内皮细胞部分凋亡晚期或坏死细胞。40×

    3 讨论

    LPS是革兰阴性细菌合成释放的主要毒素，是导致感染性休克的最重要的生物因子。内皮细胞是其主要的作用靶细胞之一，而肺、肠是最易受到攻击的靶器官［2，3］。受到攻击的肺微血管通透性增加是其重要特征，其机制与LPS导致的中性粒细胞粘附、积聚并释放各种炎性介质有关［4］，可导致肺水肿，引起低氧血症甚至ARDS，从而加重病情和病死率［5］。肠黏膜屏障功能受损导致肠壁水肿，毒素吸收增加和细菌移位，可能是导致肠源性感染的重要原因，有人报道肠通透性增加与胰腺炎预后有关［6］。

    本实验也证实，LPS可增加肺和肠微血管内皮细胞通透性，其中以肺为明显，可能与肺血流量大和肺微血管内皮细胞敏感性高有关。结果显示，LPS对肠微血管通透性的影响与剂量和时间相关，10mg/kg LPS作用后2h后其通透性即显著增加，而5mg/kg剂量反使其通透性降低，12h后方明显增加，其机制不详，可能与低剂量内毒素血症时肠血流量过度减少、微血管内皮细胞损伤相对较轻有关，也可能与内皮细胞通透性改变的组织特异性有关。实验中还发现，LPS可引起肺肉眼可见的充血和出血，并可见气道内大量积液。

    由于在体研究内皮细胞通透性十分困难，目前研究结果主要来自动物及体外细胞实验，利用干组织伊文氏蓝含量法测定微血管通透性可消除组织血流量差异带来的误差，能较为客观的反映微血管内皮细胞的通透性改变，是一种较为理想的方法［7］。过去国内外多将细胞接种于处理过的多聚碳酸微孔纤维滤膜等方法测定体外单层内皮细胞通透性，存在测定过程中需施加额外压力等人为因素，较为繁琐［8］。本实验采用预先包被胶原的商售Transwell Insert，其微孔滤膜透光，可镜下直接观察细胞生长情况，使用简单，结果较为可靠，是近年来国外普遍采用的单层内皮细胞通透性测定方法［9］。

    既往的研究已证实，凋亡可能是LPS作用后内皮细胞通透性增加的原因这一［10］，本实验也显示，100μg/L LPS时引起内皮细胞最大通透性效应，与报道基本一致［11］，同时该剂量引起明显的内皮细胞凋亡效应，进一步提示凋亡在通透性增加中的可能作用，其确切机制有待进一步研究。

    (本文图片见附页1)

【文献】

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