鼠肺表面活性物质结合蛋白D提取方法的改良及鉴定

【摘要】  目的： 提取及纯化SD大鼠肺灌洗液中表面活性物质结合蛋白D（SP-D）。方法： 取SD大鼠肺泡灌洗液，经Tris?HCl? EDTA法提取和maltose?agarose亲和层析法纯化SP?D，用SDS?PAGE电泳及SP?D与幽门螺杆菌的玻片凝集试验鉴定。结果： 从SD大鼠肺灌洗液中提取出较高浓度的蛋白，经SDS?PAGE电泳检测，分子量约43 kD，提取的蛋白可与幽门螺杆菌发生明显凝集。结论： 采用maltose?agarose亲和层析法可以从SD大鼠肺灌洗液中获得较高纯度的SP?D。

【关键词】  肺泡表面活性物质相关蛋白质D； 大鼠，Sprague?Dawley； 组织提取物； 方法； 生物学鉴定法

　　［Abstract］Objective: To isolate and purify surfactant protein D(SP?D) from SD rat bronchoalveolar lavage liquid. Metheds: SP?D were eluted from bronchoaveolar lavage fluid of SD mice with Tris?HCl?EDTA, purified by maltose?agarose affinity chromatography, and then determined by SDS polyacrylamide gel electrophresis (SDS?PAGE) and agglutination test with Helicobacter pylori. Results: SP?D with high concentration was obtained by maltose?agarose affinity chromatography. The molecular weight of the obtained SP?D was 43kDa.Helicobacter pylori could be agglutinated by the protein. Conclusion: Highly pure SP?D could be obtained from SD rat bronchoalveolar lavage liquid by affinity chromatography on maltose?agarose.

　　［Key words］ Pulmonary surfactant?associated proteins D；rats, Sprague?Dawley; tissue extracts; methods; biological assay

    肺表面活性物质结合蛋白D（Surfactant protein D,SP?D）是肺泡表面活性物质（PS）的重要蛋白成分之一[1]，在调节表面活性磷脂代谢和肺防御功能方面起重要作用[2]，临床上应用合成的肺表面活性物质呼吸窘迫综合征、胎粪吸入综合征等肺部疾病[3]。1989年Persson A等[4]通过高效液相色谱法，采用硫酸镁吸附，柠檬酸钠洗提获得SP?D，随着对其结构的深入研究，提取方法不断改进，1998年Strong P等[5]采用maltose?agarose亲和层析及Superose?6凝胶过滤，提取到了高纯度的SP?D。但由于Superose?6柱价格昂贵，使该方法的应用受到限制。综合国外，删去Superose?6柱的提取步骤，将洗提液进行调整，从SD大鼠肺泡灌洗液中进行SP?D提取，并通过SDS?PAGE电泳和与幽门螺杆菌的凝集反应对其性质进行了鉴定，报道如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物及主要试剂 

　　SD大鼠（贵阳医学院实验动物中心）。maltose?agarose(sigma)，蛋白分子量标准，EDTA，叠氮钠，Tris，盐酸，CaCl2，甘氨酸，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，过硫酸铵，TEMED及考马司亮蓝等。幽门螺杆菌NCTC11637，获赠于疾病预防控制中心。

　　1.2 方法

　　1.2.1 鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）的获取 

　　取清洁级SD大鼠9只，腹腔内注射20％乌拉坦0.5 ml/100 g，处死动物，固定、无菌操作分离出鼠肺，行气管插管后，用注射器注入15 ml无菌生理盐水，轻拍双侧肺部，然后回收获取BALF。

　　1.2.2 SPD的提取 

　　将BALF配制成20 mmol/L Tris?HCl和10 mmol/L EDTA，调节pH值为7.4，室温下搅拌1 h，在4 ℃下10 000 g离心40 min，取上清液配制成20 mmol/L CaCl2，重调pH至7.4，得SP?D粗提物。

　　1.2.3 SPD的纯化 

　　将1 ml maltose?agarose加入2 ml无菌注射器（注射器内先放一张滤纸片），制成层析柱，用含有10 mmol/L CaCl2，0.02％（W/V）叠氮钠，20 mmol/L Tris?HCl pH7.4的平衡缓冲液平衡层析柱。将SP?D粗提物加入层析柱，滤过后用含1 mmol/L NaCl、10 mmol/L CaCl2、0.02％（W/V）叠氮钠、20 mmol/L Tris?HCl pH7.4的缓冲液洗涤层析柱，再用平衡缓冲液洗涤至背景吸光水平，最后用含有10 mmol/L EDTA,pH 7.4的TBS缓冲液洗提并收集SP?D。约1 ml收集1管，同时以TBS缓冲液调零检测每管SP?D洗提液的A280值。

　　1.2.4 SDS?PAGE电泳

　　按文献方法[6]制备10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，将提取的SP?D样品15 μl与15 μl上样缓冲液混合，与蛋白分子量标准品分别加入凝胶加样孔，100 V电泳约1 h至溴酚兰指示剂接近凝胶底部，停止电泳，取出凝胶，经考马司亮蓝染色[7]后拍照。

　　1.2.5  SPD的浓缩 

　　用冷冻真空干燥器浓缩和干燥SP?D。

　　1.2.6 幽门螺杆菌与SPD的凝集试验 

　　用接种环取无菌生理盐水于玻片上，挑取幽门螺杆菌NCTC11637哥伦比亚血琼脂平板新鲜培养物于玻片上，在生理盐水中涂抹均匀，用接种环取1环500 mg/L的SP?D水溶液与玻片上的菌液充分混和，同时分别以生理盐水与菌液及生理盐水与SP?D混和作为阴性对照，轻微晃动玻片，观察凝集现象。

　　2 结果

　　2.1 SDS?PAGE电泳分析 

　　收集A280达0.05以上的洗提液，共获得SP?D洗提液约10 ml，经SDS?PAGE电泳，在分子量45 kD与35 kD之间见一条清晰条带，在分子量大于94 kDa以上亦可见一条清晰条带。见图1。

　　2.2 SPD的浓缩 

　　共提取9只大鼠BALF的SP?D，浓缩后的SP?D干粉经天平称量，获得0.131 1 g SP?D。

　　2.3 幽门螺杆菌与SPD的凝集试验 

　　幽门螺杆菌NCTC11637与SP?D可发生明显凝集现象，阴性对照未见凝集现象。

　　3 讨论
    
　　SPD是肺泡表面活性物质的重要蛋白成分之一，主要由肺泡Ⅱ型上皮细胞和克拉细胞合成[8]。SP?D参与调节肺表面活性磷脂代谢，并在肺防御功能方面起重要作用，它可与细菌表面结构结合，促使细菌发生聚集，加强中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬作用，参与致病因子的非抗体依赖性识别和清除[9]。SP?D在某些疾病时会表达异常，如卡氏肺孢子虫肺炎、肺癌等[2]。有报道证实SP?D也存在于其他组织器官，如胃、肾脏等等[9]。提取SP?D对于进一步阐明其功能及其在感染性疾病免疫中的作用具有重要意义。  
     　　
　　SPD的来源主要有天然和基因工程合成两种，在结构和活性的完整性方面，天然SPD无疑优于基因工程合成的SPD。天然SPD主要来源于羊水、肺泡蛋白沉积症患者肺泡灌洗液，由于标本量少且不易获得，从羊水及肺泡沉积症患者获取SPD有较大难度，已有从鼠、猪等动物肺泡灌洗液中获取SPD[9，10] 的报道。
     　　
　　SPD的提取方法有盐析法、凝胶过滤等方法，国外学者多采用maltose?agarose亲和层析及Superose?6凝胶过滤，但这些提取柱价格高昂，特别是Superose?6凝胶过滤柱，使该方法在国内的应用受到限制，且国内目前尚无提取SPD的报道。本实验综合国外文献方法并进行适当改良，采用Tris?HCl? EDTA法从SD大鼠的肺泡灌洗液中获得SPD粗提物后，省掉了昂贵的Superose?6柱，用自制的maltose?agarose注射器柱进行亲和层析，使SPD在Ca2+存在时吸附于柱上，再用EDTA代替容易出现沉淀的MnCl2以去除Ca2+，获得了纯度较高的SPD。从SDS?PAGE电泳结果可以看出，提取的SPD在电泳后分别可于35～45 kD及94 kD以上各见一清晰条带，与文献[4]报道的SPD可有43 kD的单体和150 kD的多聚体两种存在形式一致。经干燥浓缩后称量，maltose?agarose 1 ml可提取到约30 mg SPD。根据SPD作为一种天然免疫成分可以与幽门螺杆菌发生凝集的特性[7]，又通过玻片凝集试验观察了所提取的SP?D与幽门螺杆菌NCTC11637的凝集反应，结果表明提取的蛋白与幽门螺杆菌NCTC11637可发生肉眼可见的明显凝集，进一步证实Tris?HCl?EDTA法和maltose?agarose亲和层析法可提取到较高纯度和浓度的SP?D，为广泛、深入地进行SP?D的相关研究提供了更、实用的方法。

【文献】
  　［1］Crouch E D Parghi,S F Kuan,et al.Surfactant protein D:subcellular localization in nonciliated bronchiolar epithelial cells［J］.Am J Physiol,1992(263):L60-L66.

　　［2］瞿介明,容朝晖,何礼贤.卡氏肺孢子虫肺炎肺表面活性蛋白A和D的变化［J］.中华传染病杂志,2000(2):91-95.

　　［3］赵玉红.肺表面活性物质临床应用进展［J］.医学文选，2006(3):545-547.

　　［4］Persson A,Chang D,Rust K,et al.Purification and biochemical characterization of CP4(SP-D)［J］.Biochemitry,1989(15): 6361-6367.

　　［5］Strong P,U Kishore,C Morgan,et al.A novel method of purifying lung surfactant proteins A and D from the lung lavage of alveolar proteinosis patients and from pooled amniotic fluid.J Immunol Methods［J］.1998(220):139-149.

　　［6］张维铭.分子生物学实验手册［M］.北京出版社,2003:157-168.

　　［7］王建晖,王宝刚.蛋白质凝胶电泳的快速染色技术［J］.食品科学，2007（1）:223-224.

　　［8］Voorhout W F,T Veenendaal.Immunocytochemical localization of surfactant protein D(SP-D)in type Ⅱ cells,Clara cells,and alveolar macrophages of rat lung［J］J Histochem.Cytochemistry,1992(40):1589-1597.

　　［9］Wafa Khamri, Anthony P Moran, Mulugeta L Worku,et al.Variations in helicobacter pylori lipopolysaccharide to evade the innate immune component surfactant protein D［J］.Infec and Immun,2005(73):7677-7686.

　　［10］C M Soerensen,O L Nielsen.Purification,characterization and immunolocalization of porcine surfactant protein D［J］.Immunology,2005(114):72-82.