沙眼衣原体感染与精子凋亡关系的初探
作者：杨丹，郑立宏，高晓勤，石家齐
【摘要】 目的： 探讨精液沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)感染与精子凋亡的关系，为研究男性不育提供新思路。方法： 沙眼衣原体的检测用免疫层析法，采用瑞－姬染色精子，观察精子形态变化；用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的脱氧核苷酸原位末端标记法（TUNEL）检测凋亡精子。结果： 精液CT阳性组精子凋亡率（33.03±14.98）％，正常对照组精子凋亡率为（9.68±2.78）％，组间差异显著（P＜0.01）。结论： 精液CT感染导致精子凋亡率增加，CT感染可能是男性不育的重要原因之一。
【关键词】 精子； 衣原体,沙眼； 细胞凋亡； 不育，男性
［Abstract］Objective: To investigated the relationship of Chlamydia trachomatis (CT) infection with sperm apoptosis that might relate with male sterility. Method: Immunochromatography method was used to detect Chlamydia trachomatis; Conventional cell morphology staining (wright?gimsa staining), and terminal deoxynucleotidyl transferase enzyme (TdT) mediated deoxynucleotidyl in situ and labeling (TUNEL) were adopted for apoptosis detection. Results: Sperm apoptosis rates were 33.03±14.98% and 9.68±2.78% in CT infection group and normal fertility group respectively; There was dramatically difference between the two groups (P<0.01) , which showed that the CT infection of semen caused increase of sperm apoptotic rates. Conclusions: CT infection might be one of the most important causes for male infertility.
［Key words］ spermatozoa; chlamydia trachomatis; apoptosis; infertility,male
男性生殖道的感染是引起男性不育的重要的因素，在症状或非症状男性生殖道感染中，起关键作用的两种生物体是解脲支原体(mycoplasma urealytium;MU)和沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis;CT)。近年来，关于MU感染与男性不育的关系已有大量的报道，但CT感染对精子及男性不育的影响报道不多[1～3]， CT感染引起男性不育的机制仍不清楚。据WHO报道，每年全球约5亿人新发性传播疾病，其中的18％是由CT感染造成[4，5]。在女性中，年轻、性活跃者是生殖道CT感染的好发人群，在CT的传播中具有重要作用；在男性中，泌尿生殖道CT感染率不易确定，其原因是CT感染不易作微生物学检查或为无症状者。细胞凋亡（apoptosis）是细胞在胞外或胞内信号诱导下发生的主动自杀死亡过程，是调控机体发育、维护内环境稳定、由基因控制的细胞主动死亡过程。关于精子凋亡与男性不育的关系已有报道[6]。为明确CT感染引起男性不育的机制，于2007年对精液CT感染与精子凋亡之间的关系进行了探索。
1 材料与方法
1.1 研究对象
正常对照组15例，有正常生育史，身体健康，精液CT检测阴性，精液常规正常的自愿捐精子者；年龄24～32岁，平均（27.73±2.20）岁。CT阳性组57例，不育门诊就诊者，为婚后同居2年以上，有正常性生活，未采用任何避孕措施，睾丸、附睾、内分泌、染色体等检查无异常；精液CT检测阳性，年龄24～40岁，平均（28.81±3.31）岁，不育年限2～10年，平均（4.37±2.70）年，其配偶检查无异常。
1.2 试剂
TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒由南京凯基生物技术有限公司提供，CT快速免疫检测试剂盒由英国Unipath公司提供，1×Earle’s和10×Earle’s液由Sigma公司提供，percoll原液由南京凯基生物技术有限公司提供，TritonX?100由北京拜尔迪生物公司提供。
1.3 研究方法
所有研究对象均禁欲3～5 d，手淫法收集全程精液于无菌玻璃容器中，置于35 ℃恒温恒湿箱中液化。取液化后的精液2 ml加入底部有2 ml 45%Percoll液的离心管中，2 000 r/min离心10 min，精液细胞主要沉积于精浆和45％Percoll液之间，于精浆与45％Percoll液之间用移液器取50 μl×5次精液沉淀入另一组离心管中，加入2 ml生理盐水，充分混匀；1 500 r/min离心10 min弃上清液，加入生理盐水2 ml；充分混匀后，1 500 r/min离心10 min，弃上清液，加入生理盐水2 ml；充分混匀后，1 500 r/min，离心10 min弃上清液，加入3 ml生理盐水，充分混匀，配成一定浓度的细胞悬液。取制备好的精液细胞悬液50 μl分别滴加在普通洁净的玻片（瑞姬染色用）和多聚赖氨酸防脱玻片（TUNEL时用）上，用采血针推平，弃去多余的细胞悬液，平放、凉干。
1.4 CT检测
取液化后的精液1～2 ml，1 500r /min离心10 min，取沉淀，按照试剂盒说明书进行操作。
1.5 常规形态学染色
取制备好的普通玻片精液细胞样本，浸入瑞－姬染液中1 min，倒入等量pH6.9的PBS缓冲液，再染10 min，自来水冲洗，自然凉干后用光学树脂封片，置油镜下检查并拍照。
1.6 TdT介导的TUNEL法检测凋亡精子
取已制备好的多聚赖氨酸防脱玻片精液细胞样本浸入固定液，室温15～25 ℃固定15 min～1 h；-20 ℃的乙醇中放置2 h；PBS漂洗3次，每次5 min；浸入封闭液，室温15～25 ℃封闭10 min；PBS漂洗3次，每次5 min；浸入通透液中，冰上（2～8 ℃）促渗2 min。PBS漂洗两次，样本周围用吸水纸吸干；每个样本滴加50 μl TdT酶反应液，加盖玻片37 ℃避光湿润反应 60 min；PBS漂洗3次，样本周围用吸水纸吸干；滴加50 μl Streptavidin?HRP?工作液，加盖玻片37 ℃湿润避光反应30 min；PBS漂洗3次；滴加50 μl DAB工作液，室温显色反应10 min；PBS漂洗3次，光学显微镜下检测及拍照。
1.7 统计学处理
采用SPSS 12.0统计软件包进行χ2检验，结果用（x±s）表示。
2 结 果
2.1 精子周亡率
观察精子头尾部，计数凋亡精子，统计凋亡率（计数500个精子，凋亡精子数占总精子数的比例），正常对照组精子凋亡率为（9.68±2.78）％，CT阳性组精子凋亡率达到（33.03±14.98）％。
2.2 TdT介导的TUNEL法检查凋亡精子
随机观察正常对照组和CT阳性组精液标本，凋亡精子头部呈棕黄色（图1～4)，未凋亡精子不着色。
2.3 瑞－姬染色检查凋亡精子 凋亡精子染色质固缩（图5），核边集、呈新月状或块状小体（图6）。
3 讨论
CT是一类专性细胞内生长、有独特发育周期的原核细胞型微生物，很少从正常男性尿道中分离出来，但被认为是非淋菌性尿道炎（NGH）、附睾炎和慢性前列腺炎的主要病因之一，其对男性生育功能的影响已引起了人们的关注。研究结果显示，CT阳性组和正常对照组精子凋亡率分别为（33.03±14.98）％和（9.68±2.78）％，组间差异显著，表明精液CT感染导致精子凋亡率增加。CT感染可刺激巨噬细胞分泌IL?1、LI?6及TNF?α等细胞因子[7，8]，而TNF?α是启动细胞凋亡的重要细胞因子；同时，TNF?α增高后使转移单的还原型辅 图1 CT阳性组少精子组（TUNEL法，酶Ⅱ氧化酶含量增多，产生一系列的活性氧化物质（ROS）。过量的ROS，一方面可使精子线粒体内、外膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，使膜的脂质排列松散，内膜脊减少，ATP合成降低；另一方面过量ROS还可引起精子核的DNA发生断裂，导致精子凋亡的增加。Darville等[9]研究小鼠生殖道抗CT感染机制，发现在抗CT感染的宿主免疫应答中存在细胞介导免疫。Spadafora[10]研究证实生精细胞通过CD4分子介导免疫后，具有自发摄取外源性DNA能力，精子与外源性DNA相互作用，刺激内源性核酸导致类似凋亡的细胞死亡过程。
细胞凋亡(apoptosis)是多细胞生物普遍存在的细胞死亡形式之一。有研究显示，在生长发育、组织代谢和一些疾病等许多生理和病理过程中，凋亡都发挥着极为重要的作用。目前检测凋亡的方法很多,其中原位末端标记技术TUNEL法是分子生物学与形态学相结合的研究方法,可对完整的单个凋亡细胞或凋亡小体进行原位染色,能准确反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征。DNA裂解为许多单或寡核苷酸片断是细胞凋亡的主要生化标志。由于正常的、或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，故很少能够被染色[11]。应用TdT介导的TUNEL法检测正常对照组和CT阳性组精液标本，凋亡精子呈棕黄色，而未凋亡精子不着色。在应用TdT介导的TUNEL法检测凋亡精子的同时，应用常规瑞－姬氏染色法从另一角度检测凋亡精子，发现凋亡精子核染色质固缩并核周聚集，呈境界分明的新月形或块状小体；胞质起泡，胞质嗜酸性增强等形态结构改变，与熊承良等[12]报道一致。万长春等[13]研究表明，由于常规形态学方法不能早期发现凋亡细胞核与细胞器的改变, 故凋亡细胞百分率常规形态学染色法低于TUNEL 法, 但二者差异不显著(P>0.05)。
研究表明，精液CT感染导致了精子凋亡率增加，CT感染可能是导致男性不育的重要原因之一。
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