用PCR扩增16SrRNA基因鉴定幽门螺杆菌的细胞壁缺陷型
【摘要】 目的： 探讨幽门螺杆菌及其稳定L型的检测与鉴定方法。方法： 用抗生素诱导、滤菌器过滤、非高渗透压培养基培养获得幽门螺杆菌稳定L型纯培养物，对幽门螺杆菌及其稳定L型进行16SrRNA基因的PCR扩增及序列测定。结果： 幽门螺杆菌及其稳定L型的16SrRNA基因PCR扩增产物经1％琼脂糖电泳，在紫外检测仪下可见550 bp的DNA条带，测序结果经NCBI Blast分析比对，基因同源性可达100％。结论： 16SrRNA基因PCR检测可用于幽门螺杆菌L型及其他形态变异的菌种鉴定。
【关键词】 螺杆菌，幽门； 细胞壁； 稳定L型； 16SrRNA基因； 聚合酶链反应
［Abstract］Objective: To exploit effective methods for detection and identification of Helicobacter pylori and its stable cell wall?deficient form(L?form). Methods: Stable L?form of H. pylori was induced by ceftriaxone sodium in non?hyperosmosic medium and purified by filtration. The 16SrRNA gene of L?form and normal H. pylori were amplified by PCR and analyzed with agarose gel electroforesis and DNA sequencing. Results: The PCR products were approximately 550 bp. and their sequences were verified as 100% homology with the part of H. pylori 16SrDNA gene recorded in NCBI gene bank with blasting. Conclusion: L?form H. pylori could be identified through analyzing its 16SrDNA with PCR.
［Key words］Helicobacter pylori;cell wall; stable L?form; 16SrRNA; polymerase chain reaction
幽门螺杆菌（HP）是定植于人胃部的一种革兰阴性细菌，与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等疾病的发生密切相关[1]。HP容易发生圆球形变异，多数学者认为HP球形转化与HP感染的迁延不愈、反复发作及流行传播密切相关[2]，细胞壁缺陷型HP属于圆球形变异中的一类。由于细胞壁缺陷导致细菌的原有形态、代谢活性、表面抗原、致病性等发生改变，以致采用常规细菌学方法难以分离和鉴定，从而导致病原学诊断的漏诊、误诊甚至延误[3]。目前国内外均未见到关于HP稳定L型的鉴定方法,2007-2008年采用抗生素诱导、非高渗透压培养基培养法获得HP稳定L型，对其进行16SrRNA基因PCR检测与测序分析。
1 材料与方法
1．1 材料
菌株：HP菌株SS1、NCTC11637、NCTC11639，获赠于疾病预防控制中心传染病预防控制所。诱导剂：注射用头孢曲松钠 (Ceftriaxone sodium)，上海罗氏制药有限公司生产，批号SH0693。培养基：7%绵羊血哥伦比亚琼脂平板、PG液、布氏肉汤培养基按文献[3]及说明书方法制备。引物：参照文献[4]合成幽门螺杆菌种特异性16SrRNA基因的引物，上游引物为5′CTTGCTAGAGTGCTGATTA 3′，下游引物5′TCCCACACTCTAGAATAGT 3′，由北京天根生物工程有限公司合成，按说明书推荐方法使用。PCR扩增试剂盒和细菌基因组DNA抽提试剂盒，购自北京天根生物工程有限公司。
1．2 HP的培养
取HP菌株SS1、NCTC11637、NCTC11639分别划线接种于7%绵羊哥伦比亚血琼脂平板(5 mg/L多黏菌素，10 mg/L两性霉素，10 mg/L万古霉素)， 37 ℃微需氧条件(5%O2、10%CO2、85%N2)培养2～3 d。
1．3 HPL型的诱导及传代培养
将平板上的HP用布氏肉汤洗下后加入布氏肉汤培养液中，并加入头孢曲松钠稀释液，使其终浓度分别为100 g/L，于37 ℃微需氧培养3 d。取出后在倒置显微镜高倍镜下观察到多数细菌细胞转变成圆球形态后，取培养物以孔径为0.22 μm的滤菌器加压过滤。取过滤液加入不含抗生素的PG液中，置37 ℃培养箱内培养并逐日观察L型的生长情况，见L型密集生长后，传代培养直至获得稳定L型培养物。
1．4 HP及HPL型的生物学特性观察
包括形态与培养特性，革兰染色，细胞壁染色及尿素酶活性检测。
1．5 HP及其稳定L型DNA的提取
采用DP302?02柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，分别提取HP SS1、NCTC11637、NCTC11639菌株及其稳定L型染色体作为模板。
1．6 16SrDNA的PCR检测
PCR反应体积为50 μl，其中2×Mix Master 25 μl，DNA模板2 μl，引物各2 μl，dH2O 19 μl。反应条件为94 ℃ 5 min，继以94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，循环30次。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳、紫外检测仪检测，核酸序列测定及比较分析。
2 结果
2．1 生物学特性
倒置显微镜高倍镜下观察，HPL型为圆球或卵圆形，单个、成双、成链状或成堆排列，沉于瓶底，不运动，不黏附瓶壁。HPL型革兰染色阴性，细胞壁染色阴性，尿素酶实验阴性。
2．2 琼脂糖凝胶电泳
HPSS1、NCTC11637、NCTC11639细菌型及其稳定L型16SrRNA基因PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳,于紫外检测仪下均可见分子量约为550 bp的DNA条带(图1)。
2．3 序列测定
将HPSS1及其L型 、NCTC11637及其L型的16SrDNA PCR扩增产物测序结果分别去除两端大约20 bp不精确序列后，与NCBI geneBank数据库检索进行比对分析，与数据库中HP16SrDNA片段的基因同源性均可达到100%。
3 讨论
细菌L型是指完全丧失天然具有的细胞壁、不能自发返祖、但能够生长繁殖的细胞壁缺陷细菌，细菌L型可以在体内或体外、抗生素诱导下形成或在条件下形成[3]。由于细菌发生细胞壁缺陷后，丢失了细胞壁相关的代谢酶类及抗原物质，因此其生物学特性与亲代细菌型有明显差异，造成常规细菌学方法不能检出，从而导致对疾病的诊断、和预防的极大困难。
在暴露于抗生素、营养缺乏、气体环境不适以及延长培养时间等情况下，HP容易发生圆球形态变异[5]。实验采用抗生素诱导，非高渗透压培养基培养法成功获得了HP稳定L型。结果表明，HPL型丧失了亲代细菌型的多种生物学活性，表现为圆球或卵圆形，单个、成双、成链状或成堆排列， HPL型革兰染色阴性，细胞壁染色阴性，尿素酶实验阴性。
研究表明，细菌L型可丧失以鞭毛、普通菌毛、荚膜等表面附件为物质基础的致病作用，但仍可保留产生内毒素或外毒素等正常细菌所产生的致病物质的能力，但致病能力减弱，主要引起慢性感染[6]。贾继辉等[7]发现，HPL型与慢性感染有关；于东红等[8]认为HP的L型与胃恶性肿瘤密切相关，HPL型可能通过促进细胞增殖加速和引起基因突变而导致食管癌的发生。因此，建立特异快速的病菌鉴定方法，将有利于诊断HP及其对L型感染,有利于疾病的治疗。
16SrRNA的基因与细菌染色体上大多数基因相比有高度的保守性，16SrRNA基因的的保守区在不同科、属、种间存在不同程度的差异，因此,将16SrDNA基因的保守性和特异性结合起来应用,可进行不同种属细菌的分类与鉴定[9]。本研究结果表明，3株HP细菌型及其L型均可扩增出分子量一致的特异性产物，扩增产物的序列与NCBIgeneBANK报道的多株HP的16SrDNA基因同源性达到100%，提示幽门螺杆菌16SrDNA基因的PCR扩增可用于HP细胞壁缺陷变异或其他形态变异形式的菌种鉴定。
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