用cox1基因片段的PCR鉴别亚洲带绦虫和牛带绦虫

                         作者：陈峥宏，郎书源，吴晓娟，包怀恩

【摘要】  目的：用cox1基因片段的PCR技术对亚洲带绦虫和牛带绦虫的快速鉴别。方法: 用亚洲带绦虫和牛带绦虫线粒体cox1基因片段的特异性引物以及带绦虫cox1基因片段的通用引物，对贵州省都匀地区和从江地区的带绦虫虫卵和节片DNA进行常规PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测和核酸序列测定，并用NCBI Blast 对扩增产物的核酸序列与NCBI 数据库中带绦虫的cox1基因进行比对。结果: 5株都匀带绦虫DNA样品经亚洲带绦虫cox1基因片段的特异性引物PCR，均扩增出约260 bp的产物，PCR产物的核酸序列与NCBI 数据库中亚洲带绦虫线粒体cox1基因片段的同源性为100％；2株从江带绦虫的DNA 样品用亚洲带绦虫特异性引物和牛带绦虫特异性引物的PCR均未见扩增产物，而通用引物PCR则扩增出约1 000 bp的产物，核酸序列与NCBI 数据库中牛带绦虫线粒体cox1基因片段的同源性为99％，在牛带绦虫特异性引物的结合位点存在一个碱基差异。结论: 常规PCR扩增特异性的cox1基因片段可快速鉴定亚洲带绦虫；从江牛带绦虫株的cox1基因特异性片段部分存在变异，导致与特异性引物结合能力的差异，可采用cox1基因通用引物PCR结合测序进行鉴定。

【关键词】  线粒体cox1基因； 绦虫属； 聚合酶链反应

　　［Abstract］Objective: To distinguish Taenia asiatica from Taenia saginata by cox1 gene fragment sequence amplified with conventional polymerase chain reaction (PCR) method. Methods: The mitochondrial cox1 gene fragments of Duyun isolates and Congjiang isolates of Taenia asiatica and Taenia saginata were amplified by conventional PCR using specific primers and general primers analysis. The fragments were confirmed by agarose electrophoresis and sequencing analysis. The sequences were compared with those in NCBI database with NCBI Blast. Results: A 260bp fragment was amplified from DNA specimens of 5 Duyun isolates of Taenia, while no same fragment was amplified from DNA specimens of Congjiang isolates when using the same primers. The sequence of the 260bp fragment had a 100% identity with that of T. asiatica mitochondrial cox 1 gene reported in NCBI database. With the general primers for cox 1 gene of Taenia, a 1000bp fragment was amplified from DNA of Congjiang isolates and the sequence showed 99% identity with that of  T. saginata mitochondrial cox1 gene reported in NCBI database.Only one base variation was at the specific primer binding loci. Conclusion: T. asiatica could be identified rapidly by conventional PCR of the T. asiatica specific mitochondrial cox 1 gene fragment. But because of variations, this method was not always effective for T. saginata. In these cases,sequencing after PCR with the general primers might be useful.

　　［Key words］Taenia; mitochondria cox 1 gene; polymerase chain reaction
   
　　猪带绦虫、牛带绦虫和亚洲带绦虫是寄生人体的3种带绦虫，其中亚洲带绦虫与牛带绦虫的成虫特征几乎完全一致，依靠形态特征难以鉴别。虽然DNA探针、PCR产物限制性片段多态性已用于带绦虫的鉴别，但这些方法较为复杂，且多数研究局限在猪带绦虫和传统牛带绦虫的鉴别。Yamasaki等[1]利用多重PCR扩增线粒体cox1基因成功地对3种带绦虫进行了鉴别，但是3种带绦虫cox1基因碱基组成极为相似，并且不同地理株存在变异。贵州省存在牛带绦虫和亚洲牛带绦虫的流行[2]，为验证Yamasaki所用引物的适用性，建立亚洲带绦虫和牛带绦虫快速的鉴别方法，2008年6月～11月，采用亚洲带绦虫线粒体cox1基因片段的特异性引物和带绦虫cox1基因片段的通用引物，对采自贵州省都匀地区和从江地区的带绦虫进行了常规PCR扩增和核酸序列测定，报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源 

　　采用槟榔－南瓜子法对近期有排节片者驱虫，虫体用自来水、0.85％生理盐水漂洗后保存于灭菌的25％甘油水溶液中。共7株带绦虫样本，5株采自贵州省都匀地区，2株采自贵州省从江地区，两株都匀带绦虫和两株从江带绦虫由寄生虫学教研室张科提供，并已证实都匀带绦虫为亚洲带绦虫，从江带绦虫为牛带绦虫[3]。

　　1.2 主要试剂 

　　组织DNA提取试剂盒（TIANGEN），2×Taq PCR MasterMix(TIANGEN )，DNA Marker V（TIANGEN）。

　　1.3 PCR引物 

　　鼎安生化公司合成。亚洲带绦虫cox1基因片段的特异性引物（Tasia：5′-ACGGTTGGATTAGATGTTAAGACTA-3′）、牛带绦虫cox1基因片段的特异性引物（Tsag： 5′-TTGATTCCTTCGATGGCTTTTCTTTTG-3′）及二者通用的反向引物（Rev：5′-GACATAACATAATGAAAATG-3′）均[1]合成。带绦虫cox1基因片段的通用引物： 5′-TGGGTTTGTGGTCAGGTTTT-3′(coxF)和5′-TCCAATACGCAAGCAGACAA-3′（coxR）， 是以美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库中带绦虫的cox1基因序列为模板，利用primer 3引物设计软件设计，扩增产物为1 020 bp。

　　1.4 标本处理 

　　用0.85％生理盐水洗虫体3次，取孕节剪碎，混悬于适量生理盐水中，0.106 mm孔径不锈钢筛网过滤，将卵洗下，并用生理盐水洗涤3次备用。孕节碎片组织经生理盐水洗涤后备用。

　　1.5 DNA的提取 

　　采用DNA提取试剂盒，按说明书提取组织DNA的方法提取孕节碎片组织或虫卵的DNA，经紫外吸收法检测DNA含量。

　　1.6 cox1片段的扩增 

　　以200 ng虫卵或孕节碎片组织的DNA为模板，采用2×Taq PCR MasterMix，分别用亚洲带绦虫和牛带绦虫的特异性引物及带绦虫通用引物，对都匀和从江带绦虫进行PCR扩增。扩增程序为：94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s和72 ℃延伸90 s，35个循环之后72 ℃延伸5 min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

　　1.7 PCR产物的核酸序列测定 

　　通过Big Dye Terminator方法，将3例都匀带绦虫的特异性引物PCR产物和1例从江带绦虫的通用引物PCR产物交鼎安生化公司进行核酸序列测定，测序结果与NCBI网站的BLAST程序进行比对和分析。

　　2 结果

　　2.1 带绦虫cox1基因片段特异性引物的PCR及核酸序列测定与分析 

　　以Tasia和Rev为引物的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像系统成像，5株都匀带绦虫的DNA样品均扩增出约260 bp的产物，2株从江带绦虫的DNA 样品未见扩增产物（图1）。而以Tsag和Rev为引物的PCR经琼脂糖凝胶电泳，5株都匀带绦虫和2株从江带绦虫均未见扩增产物。3株都匀带绦虫以Tasia和Rev为引物的PCR产物核酸序列完全相同，序列如下：AGTTCGGTTACTATGATAATAGGAGTACCAA
CAGGAATAAAGGTTTTTACTTGACTTTATATGCTTT
TAAATTCTCGTGTAAATAAGAGGGATCCTATATTG
TGGTGGATAGTTTCTTTTATAGTGTTGTTTACCTTT
GGTGGTGTGACTGGTATTGTGTTGTCTGCTTGTGTA
TTGGATAAAGTTTTGCATGATACTTGATTTGTTGTT
GCCCATTTTCATTATGTTATGTC，经NCBI的BLAS
T分析，与genebank中4株亚洲带绦虫线粒体cox1基因（AB107234～107236,AB066494）片段的同源性为100％，片段起止于cox1基因的第916和第1 148个碱基，与牛带绦虫的cox1基因片段的同源性为97%～98％，233个碱基中有4～5个碱基差异。

　　M,DNA分子量；1～5，都匀带绦虫DNA；6、7，从江带绦虫DNA。

　　2.2 从江带绦虫的cox1基因片段通用引物的PCR及核酸序列测定与分析 

　　2株从江带绦虫的DNA样品经带绦虫cox1基因片段的通用引物PCR均扩增出约1 000 bp的产物，双向测序结果经序列分析软件拼接，得到942 bp的准确序列，与genebank中多株牛带绦虫cox1基因片段的同源性为99％，其中，genebank牛带绦虫cox1基因第338位碱基，即特异性引物Tsag第16个碱基（5′－3′）为G,而从江带绦虫该位点为A，与亚洲带绦虫的cox1基因片段的同源性为94%～95％。

　　3 讨论
    
　　传统的绦虫鉴别依据主要是虫体的形态学特点，包括节片的数目、头节小钩的有无、孕节的子宫分支、成节中第三卵巢叶和阴道括约肌的有无等。3种感染人体的带绦虫中，猪带绦虫可以依靠形态特征与牛带绦虫和亚洲带绦虫相鉴别，但亚洲带绦虫与牛带绦虫的成虫形态非常相似，仅依靠形态特征进行鉴别比较困难。随着分子生物学技术的，巢式PCR、PCR?RFLP等技术被用于绦虫的分子鉴别[4～6]，但多数方法仍局限于对猪带绦虫和牛带绦虫的鉴别。
     　　
　　Yamasaki等[1]通过对猪带绦虫、牛带绦虫和亚洲带绦虫线粒体cox1基因的比对分析，设计3种带绦虫特异性引物，利用多重PCR扩增成功地对3种带绦虫进行了鉴别，包括来源于我国新疆的牛带绦虫，云南的猪带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫以及的亚洲牛带绦虫。本实验采用扩增亚洲带绦虫和牛带绦虫线粒体cox1基因片段的特异性引物[1]，对采自贵州省都匀地区和从江地区的7株带绦虫进行了PCR鉴定。结果表明，5株都匀带绦虫的虫卵或节片DNA用亚洲带绦虫的特异性引物可扩增出特异性的cox1基因片段，该片段序列与NCBI genebank 中采自台湾、云南，南非和印尼的亚洲带绦虫线粒体cox1基因（AB107234～107236,AB066494）片段的同源性为100％，与张科等[3]使用r?DNA?ITS2作为分子遗传标记构建系统发育树所确定的都匀带绦虫为亚洲带绦虫的研究结果一致。实验中，以牛带绦虫的特异性引物进行的PCR[1]，无论是都匀还是从江带绦虫均未扩增出任何产物，与张科等[3]已经证实的这两株从江带绦虫为牛带绦虫的结论不符。为考证该特异性引物的适用性以及从江带绦虫的虫种，以NCBI数据库中带绦虫的cox1基因序列为模板，利用primer 3引物设计软件设计并合成通用引物，扩增产物为1 020 bp，从cox1基因的74～1 094位碱基，而牛带绦虫特异性引物Tsagi的结合位点为cox1基因的322～348位碱基。测序结果表明，从江带绦虫cox1基因片段与genebank中牛带绦虫的同源性最高，为99％，但存在1％的差异，第338位碱基为A，数据库中的则为G，这一碱基差异使特异性引物Tsagi不能与模板结合而导致PCR反应阴性。因此，Yamasaki 所采用的牛带绦虫特异性引物对于牛带绦虫的某些地理株，并不一定适用。
     　　
　　Yamasaki采用的多重PCR[1]是在同一PCR反应体系里加入3对引物，同时扩增3种带绦虫特异性片段的PCR反应，这种方法虽然具有高效性，但对模板纯度和浓度要求较高，而且需要摸索不同引物之间的比例。实验中曾尝试用该方法对各DNA样品进行扩增，但未获得扩增产物。与之相比，虽然常规PCR有时需要分别采用两对引物进行反应后才能鉴别两虫种，但这种方法对模板纯度和浓度要求较低，不存在几对引物的比例问题。因此，在通过形态学和流行病学特征排除猪带绦虫后，可采用cox1基因片段常规PCR进行亚洲带绦虫和牛带绦虫的鉴别，如果特异性引物扩增均为阴性时，则采用通用引物扩增，然后测序进行鉴定。

【】
  　　[1]Yamasaki H，Allan JC，Sato MO，et a1．DNA diferential diagnosis of taeniasis and cysticercosis by multiplex PCR[J]．J Clin．Microbiol，2004(2)：548-553．

　　[2]王正蓉，包怀恩.用mtCO1技术测定云南及贵州四地区的牛带绦虫.中国寄生虫学与寄生虫病杂志[J].2003（1）：20-23.

　　[3]张科，杨明，包怀恩.我国4省区5地牛带绦虫rDNA—ITS2序列分析[J]. 中国人兽共患病学报，2006（10）：918－921.

　　[4]Rodriguez?Hidalgo R, Geysen D, Benítez?Ortiz W, et al.Comparison of conventional techniques to differentiate between Taenia solium and Taenia saginata and an improved polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism assay using a mitochondrial 12S rDNA fragment[J].J Parasitol,2002(5):1007-1011.

　　[5]Gonzalez LM, Montero E, Harrison L J S，et a1．Differential diagnosis of Taenia saginata and Taenia solium infection by PCR[J].J Clin．Microbiol，2000 (2):737–744.

　　[6]Mayta H, Gilman RH, Prendergast E, et a1．Nested PCR for specific diagnosis of Taenia solium Taeniasis[J].J Clin．Microbiol，2008 (1):286-289.