异丙酚预处理离体乳鼠脑皮质细胞对脑缺血再灌注损伤的保护作用
【摘要】 目的： 探讨不同浓度异丙酚预处理离体乳鼠脑皮质细胞对脑缺血-再灌注损伤的保护作用。方法： 取出生24 h以内的新生SD乳鼠的脑皮质细胞,体外培养至第7 天，随机分为5组：A组（正常对照组），B组（损伤组），C1组（1 mg/L异丙酚预处理组），C2 组（3 mg/L异丙酚预处理组）和C3组(5 mg/L异丙酚预处理组)。C1、 C2 C3组第7天予以对应浓度的药物预处理，24 h后B、 C1 、C2、 C3组予200 μmol/L谷氨酸损伤0.5 h，所有组更换正常培养液继续培养24 h；观察神经细胞存活率（MTT法）、乳酸脱氢酶（LDH）漏出率、细胞凋亡率、HE染色后细胞形态变化。结果： 异丙酚预处理各组MTT量不同程度高于损伤组，LDH漏出量和凋亡细胞百分比低于损伤组；HE染色后各预处理组细胞形态受损较损伤组轻，以C2组效果最佳。结论： 异丙酚提前24 h预处理离体幼鼠脑皮质细胞对脑缺血-再灌注损伤有保护作用,其中以 3 mg/L异丙酚保护效果最佳。
【关键词】 缺血预处理 脑 再灌注损伤 二异丙酚
组织器官缺血在医学临床中常见，恢复组织灌注是抢救细胞的必经之路，再灌注一方面可挽救濒临死亡的细胞，另一方面也加重细胞损伤与死亡。预处理是近20年研究减轻缺血-再灌注损伤的途径之一，它具有相对安全、使用方便、易控制等优点，所以成为近年来的研究热点。目前异丙酚预处理动物实验颇多，细胞实验尚少，2007年5月～10月通过培养乳鼠脑皮质细胞，用不同浓度的异丙酚提前24 h对其进行预处理，谷氨酸制作缺血-再灌注损伤模型，观察不同浓度的异丙酚对脑缺血-再灌注损伤的保护效果。
1 材料和方法
1.1 材料
新生SD乳鼠（出生24 h内，由贵阳医学院实验动物中心提供），DMEM/F12培养基（HyClone公司,美国），标准胎牛血清（天津市海洋生物制品科技有限公司），异丙酚（北京费森尤斯卡比医药有限公司），依达拉奉（南京先声东元制药有限公司），即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒 （武汉博士德生物工程有限公司），LDH测试盒（南京建成生物工程研究所第一分所），MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（凯基生物科技有限公司）。
1.2 乳鼠大脑皮层神经细胞原代培养 取出生后24 h之内的新生SD乳鼠,消毒皮肤后取双侧大脑皮质,剔除软脑膜和血管，D?hank′s液冲洗两遍，用眼科剪剪成1 mm3左右的小块，终浓度0.125%胰蛋白酶常温下消化3～5 min,同时用巴士管吹打至肉眼看不到细胞团块，立刻用培养基中止消化，200目筛网过滤成单细胞悬液，细胞计数板计数，加培养基适量，调细胞浓度为105～106/L的细胞悬液，接种于96孔培养板、24孔培养板、盖玻片、50 ml培养瓶中。置37 ℃、5%CO2培养箱中孵育，第3天用含2.5 mg/L阿糖胞苷[1]培养基换液,抑制神经胶质细胞及纤维细胞生长，第6天用培养基换液。
1.3 实验分组
随机分为5组：A组（正常对照组），B组（药物损伤组），C1组（1 mg/L异丙酚预处理组），C2 组（3 mg/L异丙酚预处理组）和C3组(5 mg/L异丙酚预处理组)。
1.4 大脑皮质神经细胞鉴定 脑皮质细胞体外培养至第7天,取出24孔培养板内的盖玻片，参照即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒说明书操作，然后观察。
1.5 药物预处理
脑皮质细胞体外培养至第7天，C1组、C2组、C3组弃原培养基,分别加入相应浓度异丙酚培养基，继续培养24 h。
1.6 神经细胞损伤模型[2]
培养8 d的皮层神经细胞弃原培养基,B组、C1组、C2组、C3组加入含谷氨酸（Glu）的无血清培养基(Glu终浓度200 μmol/L),作用30 min，D?Hank′s冲洗2遍后,所有组均更换含10%胎牛血清的 DMEM/F?12培养基,继续培养24 h。
1.7 检测指标（细胞生长至第9天）
1.7.1 神经细胞存活率 将接种细胞的96孔板，每孔加50 μl MTT,在37 ℃孵育4 h，使MTT还原成甲月赞，吸出上清液，每孔加150 μl二甲基亚砜（DMSO）使甲月赞溶解，轻轻震荡，使其充分溶解，酶标仪在550 nm波长处检测每孔的光吸收值（OD），减去本底OD值，细胞存活率。细胞存活率%=（加药组细胞OD值/对照组细胞OD值）×100%。
1.7.2 LDH漏出率 24孔培养板吸取每孔培养液，参照试剂盒说明书测定各孔中OD值；留下的24孔培养板，加培养液，量与吸取量相同，用力吹打，显微镜下见细胞基本无存活，参照试剂盒说明书测定各孔中OD值。根据公式计算LDH漏出率[3]，LDH漏出率=培养液LDH的OD值/（培养液LDH的OD值+细胞匀浆液LDH的OD值）×100%。
1.7.3 细胞凋亡率 将各组细胞消化离心，收集于离心管,制成单细胞悬液,按凋亡试剂盒要求加入试剂,6 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡。
贵阳医学院学报 34卷 2期刘 辉等 异丙酚预处理离体乳鼠脑皮质细胞对脑缺血再灌注损伤的保护作用1.7.4 HE染色，倒置相差显微镜下观察神经细胞的形态学变化。
1.8 统计学处理
量化指标以（x±s）表示，分析组间差异显著性用SPSS 13.0统计软件进行方差分析和q检验，P＜0.05有显著性差异。
2 结果
2.1 大脑皮质神经细胞鉴定
细胞生长至第7天，随机抽取，进行神经元特异烯醇化酶（NSE）免疫组织化学染色，阳性着色为棕黄色，本实验反应成阳性，说明所培养细胞是脑皮质细胞。见图1。
2.2 神经细胞存活率（MTT法）测定
正常对照组与药物损伤组比较P＜0.01，C1组与损伤组比较P＜0.05，C2组与损伤组比较P＜0.01，C3组与损伤组比较P＜0.05，C1、C2、C3三组比较，P＞0.05。见表1。
2.3 LDH漏出率
正常对照组与损伤组比较，P＜0.01；C1组与损伤组比较，P＜0.05；C2组、C3组与损伤组比较，P＜0.01，但C2组P值最小；C1、C2、C3 3组比较，P＜0.01。见表1。
2.4 神经细胞凋亡率
正常对照组与药物损伤组比较，P＜0.01；异丙酚各组与损伤组比较，P＜0.01，但C2组P值最小。C1组、C3组与3 μg/ml异丙酚预处理组比较，P＜0.01。见表1。 表1 各组神经细胞存活率、LDH漏出率、细胞凋亡率比较注：与正常对照组比较，(1)P＜0.01；与损伤组比较，(2)P＜0.05，(3)P＜0.01；与C2组比较，(4)P＜0.05。
2.5 细胞形态
HE染色，正常组第9天时神经元突起明显，交织成网状，胞体较大，多数细胞呈锥体型，双极型、三极型多见,偶见单极型和圆形,折光性强,有明显立体感,突起增粗,出现末端分支。药物损伤组神经细胞明显损伤,大部分细胞胞体变小，突起皱缩、减少甚至消失，折光性减弱,细胞核破碎、部分细胞甚至溶解,但仍有少数细胞保持正常形态。各异丙酚预处理组细胞受损程度减轻，其中以C2组细胞受损程度最轻。 如图2～6。
3 讨 论
细胞离体试验，通过控制细胞的生长条件，可以得到相对均一的细胞群体，便于观察细胞的形态和生化改变，可以避免在体研究时许多复杂因素的影响。大脑皮质对缺氧非常敏感，本试验选择离体乳鼠脑皮质细胞进行培养，异丙酚对其提前24 h预处理，观察对缺血-再灌注损伤的保护作用。
缺血-再灌注损伤是一个复杂的病理过程，是多因素作用的结果。兴奋性氨基酸大量释放学说是缺血-再灌注损伤机制比较公认的学说之一。试验用Glu建立缺血-再灌注损伤模型，研究显示损伤组的细胞存活率明显下降、凋亡率明显上升、LDH漏出率明显增高，HE染色观察细胞受损严重，可能与下列机制有关。(1)缺血后兴奋性氨基酸介导大量Na+、Cl-及H2O内流，造成细胞水肿坏死;(2)激活N-甲基D-门冬氨酸受体（NMDAR），破坏细胞内外钾离子的平衡从而诱导细胞凋亡[4]，钾离子外流发生兴奋性突角后电位可激活细胞内的钙离子依赖性蛋白、 降解E等，使神经元脂膜、细胞骨架蛋白、核酸等重要结构解体；NMDAR激活后可介导Ca2+大量内流，导致细胞内Ca2+超载，激发一系列瀑布样病理生理过程，导致神经元的迟发性死亡[5]。本研究结果一方面证实了Glu终浓度200 μmol/L作用30 min，可成功建立离体幼鼠脑皮质细胞缺血-再灌注损伤模型，另一方面也证明了Glu细胞损伤学说的可能性。
人体研究显示，异丙酚血药浓度1～1.5 mg/L有镇静作用，2～6 mg/L有麻醉作用，浓度过高会对呼吸循环造成抑制，因此，实验设计了1 mg/L、3 mg/L和5 mg/L预处理组。实验结果显示，与损伤组相比，异丙酚预处理各组均可不同程度地提高细胞存活率、降低LDH漏出率、降低凋亡率；HE染色下观察细胞形态接近正常，说明异丙酚对脑皮质细胞有保护作用，3组中3 mg/L组与损伤组比较P值最小，说明该浓度保护作用最佳。研究表明，异丙酚可以抑制兴奋性氨基酸的兴奋性，提高脑内γ-氨基酸（GABA）的水平，GABA受体能与Ca2+通道耦联，减少Ca2+内流，产生突触前抑制，阻断Glu的兴奋毒性效应，达到脑保护作用；异丙酚还可减少自由基的生成和维持细胞膜及线粒体功能稳定等作用,对缺血-再灌注损伤具有保护作用 ；异丙酚可直接与自由基反应,生成2、6-二异丙基苯氧基团,使自由基灭活,抑制自由基介导的脂质过氧化反应；异丙酚还可一定程度上结合于开放的钙通道,并通过开放向失活状态转变的速率，增加L2型钙通道电流失活率。另有研究表明，线粒体基质钙浓度升高,使线粒体内膜渗透性转运孔道开放,从而使分子量达1 500 Da的分子或离子可以通过线粒体内膜,干扰线粒体的产能,继而产生缺血-再灌注损伤，异丙酚具有抑制这种非特异性孔道开放的能力。本试验可能通过上述多途径实现对脑细胞的保护作用。
通过离体细胞实验提示,异丙酚提前24 h预处理离体幼鼠脑皮质细胞对脑缺血-再灌注损伤有保护作用，这与刘颖[6]等动物实验异丙酚结果相一致，在3个剂量预处理组中，以3 mg/L异丙酚预处理组效果优于1 mg/L和5 mg/L预处理组，但其保护机制尚待进一步研究。
【】
[1]罗湘颖,杨志敏,王廷华，等.胎鼠大脑皮质神经元的体外培养及鉴定[J].神经解剖学杂志，2004（5）：505-506.
[2]Morishita S, Masuda M, Nagao M, et al. Erythropoietin recep-tor is expressed in rat hippocampal and cerebral cortical neurons,and erythropoietin prevents in vitro glutamate-induced neuronaldeath[J]. Neuroscience, 1997(76):105-116.
[3]洪庆涛,宋岳涛,唐一鹏，等.细胞培养液乳酸脱氢酶漏出率的比色测定及其应用[J].细胞生物学杂志，2004（1）:89-91.
[4]Yu SP,Yeh C,Strasser U, et al. NMDA receptormediated K+ effinx and neuronala potosis [J].Science,1999(5412):336-339.
[5]Nakayamar,Yano T,U shijimak,et al.Effects of dantrolene on extracellular glutamate concentration and neuronal death in the rat hippocampal CAI region subjected to transient ischemia [J].Anesthesiology,2002(3):705-710.
[6]刘颖，王迪芬，王俊涛，等.异丙酚预处理对脑缺血再灌注损伤保护作用的研究[J].贵阳医学院学报，2006(6)：216-220.
