小干扰RNA 对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞Snail 1表达的抑制作用

                      作者：方开云 石明隽 肖 瑛 桂华珍 郭兵 张国忠

【摘要】  目的： 观察小干扰RNA 对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞Snail1表达的抑制作用及意义。方法： 将原代培养肾小管上皮细胞分为5组，（1）对照组（含糖5.5 mmol/L）；（2）高糖组（含糖25 mmol/L）；（3）Snail1 siRNA处理组，转染Snail1 siRNA，6 h后更换为高糖（含糖25 mmol/L）培养；（4）Control siRNA处理组，转染Control siRNA作为阴性对照，6 h后换为高糖（含糖25 mmol/L）培养；（5）高渗组(含甘露醇19.5 mmol/L)。72 h后收集细胞，用Western blot检测Snail 1、Vimentin蛋白表达，用半定量RT?PCR检测Snail 1、Vimentin、成纤维细胞特异性蛋白-1（FSP?1）和纤维连接蛋白（FN）的mRNA表达。结果： 肾小管上皮细胞转染Snail1 siRNA后，与高糖组比较Snail1 mRNA和蛋白表达分别下降62%和68%（P<0.01）；与高糖组比较，Snail1 siRNA处理组Vimentin、FSP?1、FN蛋白和（或）mRNA表达显著下调（P<0.01）。结论： (1)小干扰RNA 能显著抑制高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞Snail1表达；(2)Snail1参与了高糖作用下肾小管上皮细胞病理改变，并在细胞外基质的沉积中起重要作用。

【关键词】  RNA 小干扰 上皮细胞 肾小管 snail 1 波形蛋白 蛋白质类 大鼠 Sprague?Dawley

Snail 1属于锌指转录因子Snail超家族成员，研究显示该基因在正常胚胎发育和肿瘤的浸润、转移机制中有重要作用[1，2]。报道认为Snail 1参与腹膜纤维化[3]和单侧输尿管梗阻肾脏纤维化[4]的发生。本实验前期研究发现，Snail 1蛋白在糖尿病大鼠肾小管高表达，用胰岛素将糖尿病大鼠血糖控制到正常水平后，Snail 1蛋白的表达明显减少，表明糖尿病状态促进了肾脏Snail 1的表达；并且胰岛素组大鼠在肾脏Snail 1表达回降的同时，肾功能及肾脏病理改变逐渐改善，提示Snail 1与糖尿病肾病（diabetic nephnopathy,DN）的发生、有关[5～6]。为进一步证实这一推测，2007年7月应用小RNA干扰技术，通过特异性的Snail 1 siRNA转染原代培养肾小管上皮细胞，观察高糖刺激下Snail 1表达的变化及意义。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物  雄性SD鼠，体重（100～120）g，由贵阳医学院实验动物中心提供。

    1.1.2  主要试剂  DMEM（含糖5.5mol/L）、胎牛血清（HyClone），胰蛋白酶、EDTA（Sigma）；羊抗大鼠Snail 1多克隆抗体（SC?10432）、驴抗羊lgG?HRP、TBS Blotto A Blocking Reagent、Snail 1 siRNA（SC?38399）、siRNA Transfection Reagent（sc?29528）、siRNA Transfection Medium（sc?36868）、siRNA Dilution Buffer（sc?29527）、Fluorescein Conjugated Control siRNA（sc?36869）（Santa Cruz）；抗波形蛋白（vimentin）抗体，抗β?actin抗体、SABC，DAB试剂盒(武汉博士德)。EZ Spin Column RNA Purification Kit（BBI）、RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）、Snail1、Vimentin、成纤维细胞特异性蛋白?1（fibroblast?specific protein?1, FSP1）、FN和β?actin PCR引物为上海生物工程有限公司提供。

    1.2  方法

    1.2.1  肾小管上皮细胞的原代培养  采用大鼠原代肾小管上皮细胞培养方法[7]，取初代细胞为实验所用。

    1.2.2  细胞分组、转染  初代细胞按2×105/孔接种于6孔板中，用不含抗生素的培养基（DMEM+20%FCS）培养24 h后，分为：（1）对照组，用DMEM（含糖5.5 mmol/L）+2%FCS培养；（2）高糖组，用19.5 mmol/L D?glucose+DMEM（含糖5.5 mmol/L）+2%FCS培养；（3）Snail1 siRNA处理组，按操作说明转染Snail1 siRNA，6 h后换为19.5 mmol/L D?glucose+DMEM（含糖5.5 mmol/L）+2%FCS培养；（4）Control siRNA处理组，转染Control siRNA作为siRNA阴性对照，6 h后换为19.5 mmol/L D?glucose+DMEM（含糖5.5 mmol/L）+2%FCS培养；（5）高渗组，用19.5 mmol/L D?Mannitol+DMEM（含糖 5.5mmol/L）+2%FCS培养，72 h后收集细胞。每个实验组设3个复孔，重复3次实验。

    贵阳医学院学报  34卷    2期方开云等  小干扰RNA 对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞Snail 1表达的抑制作用1.2.3  Western Blot  106个细胞加裂解液200 μl，4 ℃，裂解30 min，离心取上清液测定蛋白含量，经SDS?PAGE垂直凝胶电泳后，电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗膜后分别加抗Snail 1（1∶200）和Vimentin(1∶300)抗体，4 ℃孵育过夜；加相应二抗室温孵育2 h，ECL试剂曝光显影。用抗体剥脱液剥脱抗体后，按同样的方法与β?actin抗体（1∶500）孵育。凝胶成像系统进行图像分析，以β?actin蛋白条带作内参照，结果用靶蛋白/β?actin比值表示。

    1.2.4  半定量RT?PCR  按照试剂盒说明提取细胞总RNA,并逆转录成cDNA，PCR引物序列见表1。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性45 s,退火30 s,72 ℃延伸45 s,40个循环后充分延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统分析，待测指标与内参β?actin灰度比值。

    1.3  统计学分析

   实验结果以x±s表示，用SPSS 11.5统计软件处理。组间比较采用方差齐性检验，单因素方差分析，P<0.05认为差异有显著性。

    2  结  果

    2.1  荧光显微镜下观察   表1  PCR引物序列及扩增条件对照组未检测到Snail 1蛋白表达，Snail 1 mRNA有微量表达，高糖组两者表达均较对照组显著增高（P<0.01）。肾小管上皮细胞转染Snail 1 siRNA后，与未转染高糖组比较，其Snail 1 mRNA（图2A）和蛋白（图2B）表达水平分别下降62%和68%（P<0.01）。Control siRNA不影响Snail1表达水平。

    2.3  Vimentin mRNA和蛋白表达

    结果表明，高糖显著上调Vimentin mRNA和蛋白的表达，高渗组与对照组相比，差异无显著性，说明高糖上调肾小管上皮细胞vimentin mRNA和蛋白的表达并不依赖于细胞所处的注：1.对照组，2.高糖组，3.Snail 1 siRNA处理组，4.Control siRNA处理组，5.高渗组；（1）与对照组比较，P＜0.01;(2)与高糖组比较，P＜0.01。

    epithelial cells after the transfe ction of smail 1 siRNA高渗环境；而转染Snail1 siRNA后显著下调高糖诱导的vimentin mRNA和蛋白表达，分别达59%和58%。Control siRNA不影响高糖诱导的vimentin mRNA表达和蛋白表达，见图3。

    2.4  FN和FSP?1mRNA表达

    结果表明，高糖显著上调FN和FSP?1 mRNA表达，高渗组与对照组相比，无显著性差异，说明高糖上调肾小管上皮细胞FN 和FSP?1 mRNA表达并不依赖于细胞所处的高渗环境；而转染Snail1 siRNA后显著下调高糖诱导的FN和FSP?1 mRNA表达，分别达71%和77%（P<0.01）。Control siRNA不影响高糖诱导的肾小管上皮细胞FN和FSP?1 mRNA表达。见图4。注：1.对照组，2.高糖组，3.Snail 1 siRNA处理组，4.Control siRNA处理组，5.高渗组；（1）与对照组比较，P＜0.01;(2)与高糖组比较，P＜0.01。

　　3  讨论

    前期的观察结果提示，糖尿病状态上调大鼠肾小管上皮细胞Snail 1的表达[5，6]。DN的发病机制虽然纷繁复杂，但其始动环节为血糖显著升高，因此本次实验观察了高糖作用下原代肾小管上皮细胞中Snail 1的表达。结果表明，原代肾小管上皮细胞在高糖刺激72 h后，无论是Snail 1 mRNA还是蛋白均显著增加，说明高糖状态能上调Snail 1表达。过多的细胞外基质（extracellular matrix,ECM）沉积是肾脏纤维化重要的病理变化，而FN是ECM的重要组成成分。前期的研究发现DN大鼠Snail 1与FN mRNA表达水平呈显著正相关[5，6]，在高糖培养的肾小管上皮细胞中FN表达亦增加，提示了Snail 1参与FN生成增多的机制。

    RNA干扰(RNA Interference, RNAi)是指通过正、反义RNA片段形成双链RNA,从而特异性地抑制靶基因的转录后表达的现象[8]。作为高效、特异的调节基因表达技术, RNAi已成为基因功能研究的有力工具[9]。通过RNAi可以非常有效地下调某种特定基因的表达水平,并可快速高效地研究该基因功能及与其它基因之间的相互关系[10，11]。因此，选用RNAi技术观察Snail 1基因与高糖诱导的FN之间的相互关系，以进一步探讨该基因在ECM沉积中的作用。

    实验中利用转染Fluorescein Conjugated Control siRNA，在荧光显微镜观察到绿色荧光颗粒主要分布于核区，初步推断Snail 1 siRNA导入细胞核。进一步经半定量RT?PCR和Western blot进行检测，显示转染Snail 1 siRNA的肾小管上皮细胞在高糖刺激下Snail 1 mRNA和蛋白的表达被显著抑制，与未转染高糖组相比分别下降达62%和68%，说明RNA干扰技术对Snail基因表达抑制的有效性。

    在Snail 1 mRNA和蛋白表达显著抑制的肾小管上皮细胞，高糖诱导的FN表达被显著抑制，提示Snail 1基因对高糖诱导下肾小管上皮细胞FN的表达具有调控作用。有研究表明Snail 1基因是E-钙黏素特异性转录抑制子，Snail 1能与E?cadherin启动子特异性E?box元件结合，抑制E?cadherin转录，从而触发上皮细胞向间充质细胞转变，使上皮细胞丧失细胞间紧密黏附性，继而FN、Vimentin、FSP?1等基因表达上调[12～14]。在高糖刺激下，肾小管上皮细胞FSP1和Vimentin较正常组显著增加，说明肾小管上皮细胞发生了表型转变，成为具有分泌ECM能力的间充质细胞；而在Snail 1 siRNA处理组，FSP1和Vimentin的表达亦被显著抑制，提示Snail 1与FSP1和Vimentin之间存在密切的调控关系。推测在高糖作用下，上调的Snail 1具有触发肾小管上皮细胞向间充质细胞转变的作用，而当Snail 1 siRNA抑制Snail1表达后，阻断了肾小管上皮细胞表型转变，因而FN表达减少。

    本次实验尚不能阐述Snail 1在肾小管上皮细胞向间充质细胞转变中的确切机制，但是通过前期的在体实验和本次小干扰RNA 技术，初步证实Snail 1参与了高糖作用下肾小管上皮细胞病理改变，并在DN时肾小管间质ECM的沉积中起重要作用，为进一步探讨DN的防治措施提供新的思路。

【】
  [1]Barrallo?Gimeno A , Nieto MA. The Snail genes as inducers of cell movement and survival: implications in development and cancer[J]. Development，2005 (14)：3151-3161.

[2]Guaita S, Puig I, Franci C, et al. Snail induction of epithelial to mesenchymal transition in tumor cells is accompanied by MUC1 repression and ZEB1 expression[J]. J Biol Chem，2002(10):39209 -39216.

[3]Sato M, Muragaki Y, Saika S, et al. Targeted disruption of TGF?beta1/Smad3 signaling protects against renal tubulointerstitial fibrosis induced by unilateral ureteral obstruction[J]. J Clin Invest，2003(10)：1486 -1494.

[4]Margetts PJ, Bonniaud P, Liu Limin, et al. Transient overexpression of TGF?β1 induces epithelial mesenchymal transition in the rodent peritoneum[J].J Am Soc Nephrol，2005(2): 425-436.

[5]方开云，娄晶磊，肖瑛，等. 锌指转录因子Snail1在糖尿病大鼠肾组织中的表达[J].病理生理杂志，2008（4）：737-742.

[6]方开云，娄晶磊，肖瑛，等.TGF?β1和Snail1参与糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转变[J]. 生报,2008（1）：125-134.

[7]方开云，石明隽，肖瑛，等. 原代肾小管上皮细胞的培养和鉴定[J]. 贵阳医学院学报，2008（4）136-138.

[8]FireA, Xu S, MontgomeryM K,et al. Potentand specific genetic interference by double?stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J]. Nature, 1998 (6669): 806-811.

[9]Ruvkun G. Molecularbiology. Glimpses of a tinyRNAworld[J]. Science, 2001 (5543): 797-799.

[10]Daniel DP,Vitória M，Bentley LB,et al. Hydrophobization and bioconjugation for enhanced siRNA delivery and targeting[J] .RNA, 2007（12）: 431-456.

[11]Yu JA. RNA interference by expression of short?interfering RNAs and hapin RNAs in mammalian cells[ J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002 (9): 6047-6052.

[12]Brabletz T, Hlubek F, Spaderna S, et al..Invasion and metastasis in colorectal cancer:epithelial?mesenchymaltransition, mesenchymal?epithelial yransition, stem cells and _β?catenin[J].Cells Tissues Organs .2005（11）:56-65.

[13]Tan XY,Li YJ,Liu YH.Paricalcitol attenuates renal interstitial fibrosis in obstructive nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol .2006（10）:3382-3393.

[14]La Zhou BP, Deng J, Xia W, et al. Dual regulation of Snail by GSK?3??mediated phosphorylation in control of epithelial?mesenchymal transition[J]. Nat Cell Biol ,2004 (10)：931-940.