卵巢上皮性肿瘤组织整合素β4表达水平的检测

                      作者：张英 李智敏 莫秋 孙学刚 

【摘要】  目的： 检测整合素β4在卵巢上皮性肿瘤中的表达水平，分析其作为卵巢肿瘤早期诊断靶标的可能性。方法： 取不同病理类型卵巢上皮性肿瘤组织，Western blot 检测整合素β4的表达水平。结果： 相对于正常组织，整合素β4在良性卵巢上皮性肿瘤组织中升高的程度较为轻微，在该组织交界性肿瘤中的升高较良性的明显，在恶性肿瘤中的表达上调十分明显；随着分化水平的下降，整合素β4的表达相应增高；在临床早期，整合素β4的表达就有所增高，而在有转移的临床分期中，整合素β4的表达显著增加。结论： 整合素β4的表达程度可以作为该类恶性肿瘤的早期诊断标志物；表达水平可以作为临床预后诊断的分子候选物。

【关键词】  卵巢肿瘤； 整合素β4； 印迹法，蛋白质； 细胞分化； 卵巢上皮性肿瘤

    ［Abstract］ Objective: To detect the integrin β4 expression in epithelial ovarian tumor, so as to estimate its value as a target candidate for early diagnosis of the tumor. Methods: Epithelial ovarian tumor tissues of different pathological types were ground separately in ultra low temperature caused by liquid nitrogen，and homogenized with lysis buffer for protein extraction.After running electrophoresis on SDS-PAGE, the extracted protein samples were transferred on PVDF membrane for Western blot to detect integrin β4. Results: Expression of integrin β4 increased slightly, modestly and greatly in benign tumor, borderline tumor and malignant tumor respectively compared with normal tissues. It was discovered that the expression related to differentiation and clinical stages closely. Higher expression of integrin β4 was found in poorly differentiated tumors, or in later clinical stage of the tumor. Even in the early clinical stages, the increase of integrin β4 expression could be detected, and the expression significantly increased in cases with tumor metastasis. Conclusions: In epithelial ovarian tumor tissue, the expression of integrin β4 relates to the malignancy of the tumor. Since apparent increase of integrin β4 can be found in early stage of the tumor, it is suggested that the protein can be selected as a marker for early diagnosis.The expression level of integrin β4 closely relates to the differentiation of the tumor,which indicates  that integrin β4 can be used as an index for the prognosis of patients suffered from epithelial ovarian tumor.

    ［Key words］ ovarian neoplasms; integrin beta 4; blotting,western; cell differentiation; epithelial ovarian tumor

    卵巢肿瘤是女性最常见的肿瘤类型之一，恶性卵巢肿瘤的死亡率居妇科肿瘤首位，5年生存率一直徘徊在30%左右。由于卵巢位于盆腔深部，普通检查难以发现癌变异常，一般出现临床症状时，已经属于晚期。至今为止，对于卵巢肿瘤的早期诊断，尚缺乏有效方法。因此，寻找卵巢肿瘤早期标志物、开发相应早期诊断方法的工作就显得尤为重要。近年来，有研究发现，整合素α6β4（integrin α6β4，简称为整合素β4）在鳞癌、乳腺癌、甲状腺癌、膀胱癌、结直肠癌和胃癌中的表达水平均明显增高，而且与肿瘤细胞的恶性程度相关[1]。这些研究结果提示，整合素β4可以作为早期诊断的靶点候选标志物。然而，对于人体卵巢肿瘤组织中的整合素β4表达水平，目前国际上还缺乏研究数据。因此，拟检测不同病理类型的卵巢上皮性肿瘤组织整合素β4的表达水平，为临床诊断方法的开发提供基础研究数据。

    1  材料和方法

    1.1  仪器与试剂 

    　　台式低温高速离心机（Beckman Coulter公司）；Mini VE垂直电泳系统和半干转移仪（GE Healthcare公司）；Kodak IS2000R图像工作站（柯达公司）；Image Station Quantity One 4.4图像分析系统（BIO-RAD公司）；β-Actin 抗体（Abcam公司）；整合素 β4抗体、辣根过氧化物酶（HRP）偶联的抗兔IgG和HRP偶联的抗鼠IgG（Cell signaling Technology公司）。

    1.2  方法

    1.2.1  病例选择  73例病检查证实的卵巢上皮性肿瘤组织标本取自中山市小榄人民和南方医院妇产科2003-2008年的手术病例。患者年龄28～66岁，平均年龄52岁。其中卵巢上皮性良性肿瘤11例（浆液性囊性瘤6例，粘液性囊腺瘤5例）；卵巢上皮性交界性肿瘤12例（交界性浆液性囊性瘤6例，交界恶性粘液性囊腺瘤6例）；卵巢上皮性恶性肿瘤42例（浆液性囊性癌15例，粘液性囊腺癌12例，卵巢子宫内膜样癌9例，未分化癌6例）；正常卵巢组织8例。恶性肿瘤组织分化程度：高分化8例，中度分化18例，低分化16例。恶性肿瘤的临床分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期16例，Ⅲ期18例。正常卵巢组织取自子宫肌瘤行全子宫加双侧附件切除术的患者。全部组织在取材前，病例未经化疗。

    1.2.2  肿瘤组织蛋白质样品的制备  取-80 ℃中冻存的卵巢组织，在液氮中研磨成粉末，转移至玻璃匀浆器中，添加5倍体积的裂解缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、 1% NP40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%SDS、10% 甘油、137 mmol/L NaCl、1 mmol/LCaCl2、1 mmol/L MgCl2、50 mmol/L NaF、1 mmol/L钒酸钠，临用前加入cocktail蛋白酶抑制剂），在冰上反复研磨至研杵阻力明显减轻，超声波裂解，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，重复1次，取上清为蛋白质提取液。取50 μl提取液用Bradford方法进行蛋白质定量。

    1.2.3  Western Blot检测整合素  β4  为消除组内差异，按各病理类型进行样品分组，组内各例样品等量混合。Bradford法蛋白定量后，每组取约80 μg蛋白样品，加入5倍上样缓冲液后进行12％ SDS-PAGE，将胶上蛋白用半干转移法转印至PVDF膜。膜用5％的脱脂奶粉室温封闭1 h，与1∶1 000稀释的Ⅰ抗4 ℃孵育过夜，以及HRP偶联的相应Ⅱ抗（1∶2 000稀释）室温孵育1 h，然后利用Kodak IS 2 000 R图像工作站进行化学发光法检测。曝光获取的图像用Quantity One 4.4进行蛋白条带灰度分析。每组样品重复上样检测5次。

    1.2.4  数据分析及统计方法  以条带灰度值作为蛋白质的半定量值，为消除上样量差异的影响，将各组整合素 β4条带灰度值除以本组β-actin条带灰度值获得相对灰度值。用软件SPSS 16.0进行One-way ANOVA 统计分析。

    2  结果

    2.1  不同病理类型的卵巢上皮性肿瘤组织中整合素β4的表达水平

    　　如图1所示，整合素β4在卵巢上皮性肿瘤组织中的表达水平有所增高。在浆液性囊腺瘤和粘液性囊腺瘤等良性肿瘤组织中，整合素β4的表达水平较正常卵巢组织略有增高；在交界性浆液性囊腺瘤和交界恶性粘液性囊腺瘤等潜在恶性的肿瘤组织中，整合素β4表达量的增高变得明显，为正常对照的1.5倍（P<0.01）；而在恶性卵巢上皮组织中，整合素β4的表达量为正常对照的2倍以上（P<0.01），尤其是在恶性程度很高的未分化癌中，整合素β4的表达到达正常对照的3倍多（P<0.01）。相同恶性程度的不同类型肿瘤组织中，整合素 β4的表达水平差异不明显（P>0.05）。

    2.2  不同分化程度及不同临床分期的卵巢上皮癌中整合素β4的表达水平

    如图2A所示，随着肿瘤组织细胞的分化程度降低，整合素β4的表达水平也相应增高，其中以低分化水平的表达量最高。如图2B所示，整合素β4的表达水平在不同临床分期的卵巢癌中也不一样，在Ⅱ期、Ⅲ期中的表达水平相对于I期明显增高，三者中以Ⅲ期的表达水平最高。

　　3  讨论

    　　整合素家族是一组细胞膜糖蛋白受体。由于这类蛋白可以介导细胞信号转导，调控细胞的生长与生存，通过参与细胞骨架重构影响细胞运动，因此在肿瘤细胞生物学行为中具有重要的意义[2]。一般在肿瘤发生过程中，这类蛋白质的表达和功能状态均有不同程度的改变。近年来发现，其家族成员中的整合素β4对肿瘤的发生、发展具有重要作用[3]。整合素β4由α6和β4两个亚单位组成异二聚体，是构成半桥粒的重要组成部分[4]。在多种组织来源的恶性肿瘤细胞中，整合素β4的表达水平增高，并且脱离半桥粒结构，游离分布于细胞膜，导致半桥粒结构消失，细胞骨架重构，肿瘤细胞脱离基底膜，失去极性。增高、游离的整合素β4扮演着重要的细胞信号转导功能，激活转录因子STAT3和c-Jun，这时的细胞往往表现出较强的增殖能力、迁移力和侵袭力[5,6]。

    　　本研究发现，整合素β4在卵巢上皮性肿瘤组织中的表达水平也有不同程度的增高。其中，良性肿瘤组织的整合素β4略高于正常组织，交界性肿瘤的整合素β4较良性进一步升高，恶性肿瘤中，整合素 β4增高的水平十分明显，是正常组织的2倍以上。结果提示，随着肿瘤恶性程度的增高，整合素β4的表达水平增高。

    　　本研究实验将相同病理类型卵巢癌的蛋白提取液混合后上样检测，消除了组内差异带来的影响。但是这种方法掩盖了不同分化程度和不同临床分期的恶性肿瘤组织间整合素β4表达水平的差异。为了解上述2个因素与整合素β4表达量之间的关系，研究进一步将相同分化程度和相同临床分期的肿瘤组织提取液混合后进行检测。结果发现，随着上皮性卵巢癌的分化程度下降，整合素β4的表达水平相应增高；而对临床分期而言，早期上皮性卵巢癌的整合素β4就有明显增高，而在有转移的临床分期病例中，整合素β4表达水平进一步增加。结果表明，整合素β4表达水平的增高预示着卵巢恶性肿瘤细胞分化程度的下降，迁移浸润能力的增强，因此其可以作为上皮性卵巢肿瘤预后的临床指标；整合素β4在肿瘤临床早、中期就有明显的增高，表明其可以作为卵巢癌早期靶标的候选物。

【】
  [1]Mercurio AM, Rabinovitz I. Towards a mechanistic understanding of tumor invasion-lessons from the alpha6beta 4 integrin[J]. Semin Cancer Biol,2001(2):129-141.

[2]Hood JD, Cheresh DA. Role of integrins in cell invasion and migration[J].Nat Rev Cancer,2002(2):91-100.

[3]Buczek-Thomas JA,Chen N,Hasan T.lntegis-mediated adhesion and signalling in Orarian cancer cells[J].Cell Signal 1998(1):55-63.

[4]Alt A,Ohbe M,Li L,et al.Protein Kinase Cdelta-mediated phosphorylation of alphal beta4 is associated with reduced integin localization to the hemidesmosome and decreased Keratinocyfe attachment[J].Cancer Res,2001(11):4591-4598.

[5]Guo W, Pylayeva Y, Pepe A,et al. Beta 4 integrin amplifies ErbB2 signaling to promote mammary tumorigenesis[J].Cell,2006(3):489-502.

[6]Muthuswamy SK. ErbB2 makes beta 4 integrin an accomplice in tumorigenesis[J].Cell,2006(3):443-445.