自身免疫性肝炎患者血清中高迁移率族蛋白B1检测

                   作者：赵擎，辛绍杰，侯俊，胡燕，貌盼勇 

【摘要】  　　目的 采用ELISA检测方法，初步探讨人高迁移率族蛋白B1(HMGB1)与自身免疫性肝炎(AIH)发病的相互作用关系。方法 将纯化的HMGB1蛋白，包被ELISA检测微孔板，检测AIH患者和健康献血员的血清分别165份和69份，分析比较AIH患者和健康献血员的血清中抗HMGB1抗体的分泌情况。结果 AIH患者血清中抗HMGB1抗体的阳性率明显高于健康献血员(78.7% VS 50.7% ，P<0.05)。直线回归分析显示，抗HMGB1抗体滴度(OD值)与ALT水平有很好的相关性(相关系数r=0.968)。结论 HMGB1是AIH疾病发生中一个重要的炎症蛋白，与疾病的炎症活动程度有很好的相关性。

【关键词】  高迁移率族蛋白B1 自身免疫性肝炎 ELISA

　　Abstract:　　Objective Adaption the method of ELISA, investigation the relationship between the human high mobility group box-1 protein (HMGB1) and autoimmune hepatitis (AIH). Methods Coating the microwell plate using purified HMGB1 protein, detection the serum of the 165 AIH and 69 healthy respectively. Comparison the level of Anti-HMGB1 antibody in AIH and the healthy. Results The positive ratio of Anti-HMGB1 antibody in AIH more than that in healthy (78.7% VS 50.7% ，P<0.05), The linear regression analysis showed there were good correlation between the anti-HMGB1 antibody titer and the level of alanine transarninase(ALT) (correlation coefficient, r=0.968). Conclusion HMGB1 is a crucial inflammatory protein in the progressing of AIH, there are good correlation between the anti-HMGB1 antibody titer and the stage of inflammation in AIH.

　　Keywords:high mobility group box-1 protein （HMGB1）；autoimmune hepatitis（ AIH）；ELISA

　　血循环中自身抗体的检测是自身免疫性肝炎(AIH)诊断和分型的主要依据。但自身抗体的检测并不能完全排除其他原因引起的肝脏病变，药物性肝炎、病毒感染等也可产生相应的自身抗体[1]。高迁移率族蛋白 (HMG)是存在于真核生物细胞内的一类非组蛋白染色体结合蛋白[2]。研究显示HMGB1是p-ANCA的一种新型靶抗原分子，AIH患者体内抗HMGB1抗体的阳性率达89%;在p-ANCA阳性的AIH患者体内，抗HMGB1抗体的阳性率为96%，两者具有很好的相关性[3]。本实验将前期实验纯化所得的HMGB1蛋白[4]，包被ELISA检测微孔板，检测AIH患者的血清共计165份，分析比较AIH患者和健康献血员的血清中抗HMGB1抗体的分泌情况，初步探讨HMGB1蛋白与AIH发病的相互作用关系。

　　1　材料和方法

　　1.1　标本来源　收集3022002年至2006年临床诊断为AIH患者的血清共计165份，健康献血员的血清由302医院输血科提供。

　　1.2　主要试剂　人重组HMGB1蛋白，小鼠抗人HMGB1抗体购自美国Sigma公司。辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG由解放军302医院病毒研究室提供。显色液A液、B液、终止液购自北京科卫临床诊断试剂公司。枸橼酸盐缓冲液(0.01M pH6.0)，抗体稀释液，DAB Kit(20×)购自北京中杉生物技术公司。

　　1.3　ELISA试验步骤　将纯化所得HMGB1蛋白与CB包被液按1∶200的比例混匀，加入微孔板中，每孔加入100μl，4℃静置过夜孵育。用PBST洗涤液洗板2次。每孔加100μl封闭液，37℃孵育封闭1h。用PBST洗涤液洗板2次。每孔加入(50-100)μl待测血清样品稀释液(血清稀释比例为1∶100)，37℃孵育45min。PBST洗涤液洗板5次。依次在每孔中加显色液A液、B液各50μl，混匀，37℃避光孵育10min。依次在每孔中加入终止液50μl，混匀。酶标仪对空白孔调零，单波长450nm读取各孔的OD值。

　　1.4　统计学处理　采用CHISS统计软件，数据采用卡方检验和直线相关分析。

　　2　结果

　　规定OD值大于2×cut off值的为阳性结果。统计学分析结果显示，AIH患者血清中抗HMGB1抗体的阳性率明显高于健康献血员(78.7% VS 50.7% )(x2=18.4286 ，P<0.001)，有统计学意义。并且，直线回归分析显示，抗HMGB1抗体滴度(OD值)与ALT水平有很好的相关性(相关系数r=0.968，图1)。

　　3　讨论

　　AIH是一种肝脏的炎症性疾病，特点为具有肝病和(或)非特异性的体质性临床表现，血清氨基转移酶升高，血液循环中可检测到一些非器官特异和肝特异的自身抗体，并且伴有高丙种球蛋白G(IgG)血症[5]。AIH病因尚不清楚，目前多认为可能与遗传因素或病毒感染后通过分子模拟机制诱导机体发生自身免疫反应有关[5,6]。HMG是存在于真核生物细胞内的一类非组蛋白染色体结合蛋白，HMG又分为HMGA、HMGB、HMGN家族[2]。已有研究显示HMGB1与AIH的转归有关[3]。AIH患者体内抗HMGB1抗体滴度较PBC、慢性乙型和丙型肝炎患者的要高。并且将HMGB1与AIH血清预混可导致p-ANCA抗体滴度的显著下降[3]。以上均提示HMGB1是AIH的一种新型靶抗原。ANA、SMA阳性虽然是典型的Ⅰ型AIH的血清学标志，但无论是抗体滴度还是抗体活性都不能作为疾病严重性或疾病进展的准确性标志[7]。现有的研究资料表明抗HMGB1抗体是独立于ANA、SMA而单独存在的，与AIH及其合并的肝硬化、PBC和PSC较ANA、SMA等传统抗体具有更好相关性[3,7]，由此推论抗HMGB1抗体可能是AIH进展严重性的标记。而且，抗HMGB1抗体较ANA、SMA的检测方法简单快捷，更加方便临床上监测疾病的发生、发展和转归。本实验研究发现AIH患者血清中抗HMGB1抗体的阳性率明显高于健康献血员(78.7% VS 50.7% )。并且，抗HMGB1抗体滴度(OD值)与ALT水平有很好的相关性。可见HMGB1与AIH的炎症活动密切相关。但是，对于HMGB1在AIH发病中的作用机制尚不清楚。新近研究发现，HMGB1可与IL-1、IL-6、TNF-α、IL-8、巨噬细胞移动抑制蛋白等重要的炎症因子相互诱生[8]。由此推论，某一始动因素如遗传因素或病毒感染引起肝细胞、肝窦内淋巴细胞、巨噬细胞等分泌HMGB1，HMGB1与炎症分子相互诱生介导一系列炎症介质的释放，引起AIH炎症性活动;或者HMGB1与抗HMGB1抗体结合，调节AIH的免疫炎症过程。总之，HMGB1是AIH疾病发生发展中一个重要的炎症蛋白，与疾病的炎症活动程度有很好的相关性。

【】
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