丹参注射液对梗阻性肾病大鼠肾功能及TGF?β1表达的影响

                   作者：桂泽红 代睿欣 邓时贵 韩凌 孙静 石灵春

【摘要】  ［目的］观察丹参注射液对梗阻性肾病大鼠肾组织转化生长因子β1（TGF?β1）表达、肾功能及肾病理组织学的影响。［方法］采用半结扎法建立尿路梗阻性肾病大鼠模型，观察丹参注射液性给药对尿路梗阻性肾病大鼠肾组织TGF?β1表达（RT?PCR法）、血清肌酐（碱性苦味酸法）、尿素氮（尿素酶法）及肾病理组织学（常规He染色）的影响。［结果］1、大鼠尿路梗阻3d，模型对照组血清肌酐、尿素氮均升高，其中尿素氮升高明显，有显著性差异，但血肌酐升高不明显；丹参治疗组结果类似。术后3d模型对照组和丹参治疗组血清肌酐、尿素氮比较，均P>0.05。大鼠尿路梗阻14d血清肌酐、尿素氮持续升高。丹参治疗组血清肌酐、尿素氮均降低，其中尿素氮降低明显，但仍高于假手术组。大鼠尿路梗阻56d，模型对照组血清尿素氮在高位水平，而血肌酐变化不明显；丹参治疗组结果类似。2、与假手术组比较，模型组肾TGF?β1mRNA呈高表达趋势；丹参治疗组各时点对肾组织TGF?β1mRNA表达未见明显影响，但趋势显示丹参治疗给药可能有轻微抑制TGF?β1mRNA表达。3、病理结果：模型组肾小球及肾小管呈固缩性改变，肾小管广泛坏死；丹参治疗组肾小球及肾小管呈固缩性改变，肾小球个别坏死。［结论］尿路梗阻性肾病大鼠长期注射丹参注射液有助于减少肾小球坏死、改善肾脏功能。

【关键词】  梗阻性肾病；丹参注射液；转化生长因子β1；大鼠

　　Abstract：［Objective］To observe the effect of Salvia Injection on obstructive nephropathy rats’ kidney function,TGF?β1 expression,pathology and histology,primarily discuss its protective mechanism.［Method］Take half?ligation to set rats model of urinary obstruction,observe the effect of Salvia Injection on their TGF?β1 expression(RT?PCR method),serum creatinine(picric acid method),BUN(urease method),pathology and histology(routine He Dye).［Result］1.After 3d,in model control group,the serum creatinine and BUN are increased,the latter is more apparent,with marked difference;that of Salvia Injection treatment is similar,all P>0.05.After 14d,they are continually increased;but that in Salvia treatment group is decreased,among which BUN is more apparent,but still higher than false operation group.After 56d,the serum BUN is in high level in model control group,while creatinine changes little;Salvia treatment group has similar result.2.Compared to false operation group,the TGF?β1mRNA expression in model group is in high level;there’s no marked effect of Salvia treatment group on TGF?β1mRNA in every time point,but the trend shows Salvia may slightly inhibit its expression.3.For the pathological result: in model group,the glomerular and tubular are in shrinkage change,the tubular is in broad putrescence;so is in Salvia treatment group,except the glomerular is in individually necrosis.［Conclusion］Long applying Salvia Injection is helpful to reduce glomerular necrosis and improve kidney function for urinary obstructive nephropathy rats.

　　Key words: obstructive nephropathy;Salvia Injection;TGF?β1;rats
   
　　梗阻性肾病(obstructive nephropathy)是指因尿路梗阻引起排尿障碍、梗阻上方压力增高，最终导致肾实质损害和肾功能障碍而引起的综合征。如何阻止和延缓肾功能的损害，促进受损肾单位的恢复是治疗该病的关键。本研究就丹参在急性梗阻性肾病的可能机制做了初步研究，研究结果如下。

　　1  材料

　　1.1  实验动物  SD大鼠，80只，SPF级，雌雄各半，180g左右，合格证号:0012625，由广州中医药大学实验动物中心提供。

　　1.2  实验试剂  丹参注射液 正大青春宝药业有限公司；生理盐水 广东大冢制药有限公司。TRIZOL 南京凯基生物技术有限公司。DEPC?H2O 上海生物工程有限公司提供。TIANScript RT Kit cDNA第一链合成试剂盒，RealMasterMix(SYBR Green)试剂盒 均由Tiangen biotech（Beijing）Co.，LTD提供。引物：TGF?β1（146bp）：正5’?TGAGTGGCTGTCTTTTGACG?3’，负5’?TGGGACTGATCCCATTGATT?3’；β?actin（206bp）：正5’?CGTAAAGACCTCTATGCCAA?3’，负5’?AGCCATGCCAA ATGTGTCAT?3’，由上海生物工程有限公司合成。

　　1.3  实验仪器  PE?9600型基因扩增仪  GeneAmp PCR System 9600 PERKIN ELMER（PE公司）；Modular PI生化分析仪。

　　2  方法

　　2.1  尿路梗阻大鼠模型的建立  动物麻醉后，暴露膀胱，在双侧输尿管与膀胱连接处上方1cm处，钝性分离输尿管，将直径为0.35mm的针灸针与输尿管平行并排并以细线两端结扎，然后将针灸针拔出，复位缝合皮肤，动物苏醒饲养并给药。分别于术后第12h、3d、14d、58d抽血，查血清肌酐、尿素氮，并于每时段模型组、治疗组中各断头处死10支大鼠，切取双肾，进行病理组织学检查及RT?PCR检测TGF?β1基因表达研究。

　　2.2  分组与给药  大鼠分成丹参治疗组、对照组和假手术组。丹参治疗组12h：在手术后第5小时腹腔注射丹参治疗1次（剂量为6.25ml/kg），第12h药后心脏采血测血清肌酐、尿素氮，处死动物10只取双侧肾置-70℃冰箱保存，用于检测肾TGF?β1mRNA表达（RT?PCR法）和肾病理组织学检查（下同）。丹参治疗3d组连续给药3d，1次/d，第3天给药后2h采标本。丹参治疗14d组连续给药14d，1次/d，第14d给药后2h采标本。丹参治疗56d组连续给药56d，1次/d，第56d给药后2h采标本。模型组所有动物按丹参治疗组对应时间给水，其余操作同上。假手术组动物仅开腹，不做其它手术处理。

　　2.3  肾功能检测、TGF?β1 mRNA 表达及病理组织学检查  肌酐的检测方法：碱性苦味酸法；尿素氮的检测方法：尿素酶法。检测仪器：Modular PI生化分析仪。RT—PCR法，严格按照试剂盒说明书提取、分离肾组织RNA，紫外分光光度计测定样品在260nm和280nm的吸收值，确定RNA 的质量。按1 OD260=40μg RNA RNA 的产率；OD260/OD280在1.8～2.0视为抽提的RNA 纯度很高，可用于实验。逆转录聚合酶链反应方法检测大鼠TGF?β1 mRNA的表达。病理组织学检查（各时段每组随机选2只）：观察肾皮质有核细胞技术情况，同时光镜下观察肾间质水肿及纤维化情况。

　　2.4  统计分析  两组均数比较t检验（方差齐）或t′（方差不齐）。

　　3  结果

　　3.1  丹参注射液对尿路梗阻性肾病大鼠血清肌酐/尿素氮的影响  大鼠尿路梗阻3d，模型对照组血清肌酐、尿素氮均升高，其中尿素氮升高明显，与假手术组比较P<0.05，有显著性差异，但血肌酐升高不明显；丹参组结果类似。术后3d模型对照组和丹参治疗组血清肌酐、尿素氮比较，均P>0.05。
       
　　大鼠尿路梗阻14d血清肌酐、尿素氮持续升高，与假手术组比较均P<0.05，差异有显著性。丹参治疗组血清肌酐、尿素氮均降低，其中尿素氮降低明显，与模型组14d比较P<0.05，差异有显著意义，但仍高于假手术组。提示：大鼠尿路梗阻14d肾功能损害进一步加剧，较长时间应用丹参治疗（14d），可能对大鼠肾功能损害有一定的治疗作用。大鼠尿路梗阻56d，模型对照组血清尿素氮在高位水平，与假手术组比较P<0.05，有显著性差异，而血肌酐变化不明显；丹参治疗组结果类似。

  　表1  中药丹参注射液对尿路梗阻性肾病大鼠血清肌酐/尿素氮的影响（略）

　　与假手术组比较：aP<0.01，bP<0.05；与模型对照组（对应时间点）比较：cP<0.01

　　3.2  丹参注射液对尿路梗阻性肾病大鼠肾TGF?β1mRNA表达的影响  Fig1：随着尿路梗阻时间的延长，模型组大鼠肾TGF?β1mRNA表达有逐渐增加趋势，以术后第14d表达较明显，随后TGF?β1mRNA表达趋于正常。提示：尿路梗阻性肾病大鼠肾TGF?β1mRNA呈高表达趋势。由Fig2可见，丹参治疗给药对尿路梗阻性肾病大鼠各时间点的肾组织TGF?β1mRNA表达未见明显影响，但趋势显示丹参治疗给药可能有轻微抑制TGF?β1mRNA表达作用。提示，丹参治疗给药对尿路梗阻性肾病大鼠肾组织TGF?β1mRNA有抑制作用，但作用不明显。
   
　　图1  尿路梗阻性肾病大量肾TGF?β 1mRNA的表达（模型组）（略）   

　　图2  丹参治疗给药对尿路梗阻性肾病大鼠肾TGF?β 1mRNA表达的影响（略）

　　3.3  丹参注射液对尿路梗阻性肾病大鼠病理改变的影响  模型组、丹参治疗组实验动物的显微镜下的病理改变均出现坏死性改变，同一时间条件下比较，两组间肾小球和肾小管的坏死程度和范围有显著性差异（P<0.05）；对照组肾小球及肾小管呈固缩性改变，肾小管广泛坏死；丹参治疗组肾小球及肾小管呈固缩性改变，肾小球个别坏死。见图3。
   
　　图3  注射液对尿路梗阻性肾病大鼠肾病理改变的影响A（丹参治疗组）  肾小球及肾小管呈固缩性改变，未见坏死（略）

　　4  讨论
       
　　梗阻性肾病是指因尿路梗阻引起排尿障碍、梗阻上方压力增高，最终导致肾实质损害和肾功能障碍而引起的的综合征，它是急性、慢性肾功能衰竭的常见原因之一。治疗上以解除梗阻，保护“健存”肾单位，延缓“健存”肾单位的破坏速度，控制CRF的进展为目的。
       
　　相关实验研究显示：丹参可改善CRF患者的高凝状态，其提取物丹参多酚酸盐能降低慢性肾衰大鼠血浆内皮素，抑制系膜细胞增殖和细胞外基质增生，减轻肾小球纤维化，改善肾功能［1］；丹参成分LSA可使血中PGE2呈增加或增加趋势,显示丹参可通过前列腺素系统提高肾功能［2］；丹参提取物能增加肾小球滤过率、肾血浆流量和肾流量，对肾实质有保护作用［3］。本研究显示长期应用丹参可改善梗阻性肾病大鼠肾脏功能，延缓肾脏损害过程，保护肾单位，其作用过程可能为多种机制的共同参与。
       
　　有关梗阻性肾病的发病机理大多数学者倾向认为本病是以梗阻为启动因素，多种血管活性物质、生长因子、细胞因子、化学趋化蛋白、反应氧代谢产物等综合作用的结果，转化生长因子β1(TGF?β1)便是其中最重要的细胞因子之一。本研究显示：丹参注射液有轻微抑制TGF?β1的基因表达，对延缓“健存”肾单位的破坏速度有积极意义。

【】
  1］ 徐曼，王逸平，孙伟康，等.丹参多酚酸盐对大鼠慢性肾功能衰竭时肾功能及内源性内皮素释放的影响［J］.药与毒理学杂志，2001，15(1)：39?42.

　　［2］ 横泽隆子,李太雄,大浦彦香,等.肾不全ぅシトに对する丹参成分Lithospermie acid の作用［J］.日肾志，1989，31（5）：561.

　　［3］ 赵刚，和水祥，符寒，等.丹参酮ⅡA对人肝癌细胞TGF?β1基因表达的影响［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2006，15（8）：396HT398.