胃癌组织中P16，C?MYC和COX?2的表达及其与患者预后的关系

                    作者：翟俊山 李楠 张林 王艳梅 朱超慧 吴凯

【摘要】  目的］探讨胃癌组织中P16，C?MYC和COX?2表达情况、相互关系及其与患者预后的关系。［方法］应用免疫组化SABC法检测104例手术切除胃癌组织中P16，C?MYC和COX?2的表达。［结果］胃癌中P16，C?MYC和COX?2表达阳性率分别39.4%(41/104)，57.7%(60/104)，63.5%(66/104)。P16的表达在胃癌中与不同的浸润深度，淋巴结有无转移，TNM分期，不同组织学类型均有显著差异(P＜0.05)；C?MYC的表达在胃癌中与不同的浸润深度，淋巴结有无转移，TNM分期有显著差异(P＜0.05)，而与不同组织学类型无统计学差别(P＞0.05)；COX?2的表达在胃癌中与淋巴结有无转移，TNM分期，不同组织学类型均有显著差异(P＜0.05)，而与不同的浸润深度无统计学差别(P＞0.05)。而它们与肿瘤患者年龄，性别均无统计学差异(P＞0.05)。等级相关分析结果显示P16与C?MYC、COX?2表达呈负相关(P＜0.05)，C?MYC与COX?2表达呈正相关(P＜0.05)。生存曲线研究结果显示P16，C?MYC和COX?2表达与患者术后生存时间显著相关(P＜0.05)。［结论］P16在胃癌组织中低表达及C?MYC和COX?2高表达能客观反映胃癌组织分化程度，侵袭转移能力，且其与患者预后密切相关。故检测三种指标可正确判断胃癌患者预后，在指导临床方面有一定价值。

【关键词】  P16；C?MYC；COX?2；胃癌；预后；基因表达

　　Abstract：［Objective］To investigate the expression of P16，C?MYC and COX?2 in gastric carcinoma and relationship with the pathogenesis，infiltration，metastasis，prognosis of the patients.［Method］ The expressions of P16，C?MYC and COX?2 were detected by inununohistochemical methods in 104 surgical resection specimens.［Result］The positive expression rates of P16，C?MYC and COX?2 were 39.4%(41/104),57.7%(60/104),63.5%(66/104).The expression of P16 was notably correlated with the depth of invasion，lymph nodes metastasis，pathologic type，TNM stage in gastric carcinoma (P＜0.05)；the expression of C?MYC was notably correlated with the depth of invasion，lymph nodes metastasis，TNM stage in gastric carcinoma (P＜0.05),but not related to the pathologic type(P＞0.05)；the expression of COX?2 was notably correlated with lymph nodes metastasis，pathologic type，TNM stage in gastric carcinoma (P＜0.05),but not related to the depth of invasion(P＞0.05)；they all were not related to the age and sex (P＞0.05).The expression of P16 was negatively correlated with C?MYC and COX?2 protein (P＜0.05).The expression of C?MYC protein was positively associated with that of COX?2. Also，the expressions of P16，C?MYC and COX?2 were obviously correlated with the survival time of postoperative patients (P＜0.05).［Conclusion］ The lower expression of P16 and higher expression of C?MYC and COX?2 reflected prognosis of patient with gastric carcinoma; combining detection of P16，C?MYC and COX?2 may be helpful for predicting the prognosis of the patients with GC，which is significant in clinical application.

　　Key words：P16；C?MYC；COX?2；gastric carcinoma；prognosis；gene expression
   
　　本文用免疫组化SABC法联合检测抑癌基因P16，癌基因C?MYC和COX?2在手术切除胃癌细胞中的表达水平，探讨P16，C?MYC和COX?2表达产物与胃癌的浸润深度，淋巴结转移，TNM分期、病理分型及与患者预后的关系。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  收集解放军总第二附属医院从1999年至2004年，104例术后病理证实为胃恶性肿瘤的存档组织蜡块。男77例，女27例，年龄26～80岁，平均57.7岁。所有病例术前均未予非甾体类药、抗生素、化疗和放疗等治疗。

　　1.2  试剂  兔抗人环氧化物酶2（COX?2）单克隆抗体、鼠抗人p16单克隆抗体及p16阳性对照片、COX?2阳性对照片购于北京中杉金桥生物技术有限公司，鼠抗人C?myc单克隆抗体与C－myc阳性对照片购于福州迈新生物技术开发有限公司，SABC（兔IgG）?POD试剂盒（SA1022)与DAB显色试剂盒(蓝)(AR1025)：购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.3  方法

　　1.3.1  免疫组化SABC操作方法  按试剂盒说明书操作，所有一抗经预试验后以1：100稀释，用PBS代替一抗作空白对照，以正常鼠血清替代一抗做阴性对照，所购阳性组织切片同样染色作阳性对照。按阳性染色细胞的百分率≤10%记为(－)，>10%记为(+)。观察P16，C?MYC和COX?2的表达，及三者与不同的浸润深度，淋巴结有无转移，TNM分期，不同组织学类型间的差异。

　　1.3.2  随访  所有病例经电话或门诊等随访，随访时间最长为5年。5年后仍存活的患者，其生存时间视为5年。

　　1.3.3  统计学处理  所有数据用CHISS统计软件包进行分析，计数资料用x2检验，相关分析采用Spearman等级相关，Kaplan?Meier法作生存率曲线，生存率比较用log?rank检验，预后分析采用COX多因素回归分析，P＜0.05视为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  胃癌中P16，C?MYC和COX?2的表达  p16蛋白和C?myc蛋白表达阳性均为胃癌细胞核与细胞浆棕黄着色,其阳性率分别为39.4%(41/104)、57.7%(60/104)；COX?2蛋白表达阳性为胃癌细胞浆和细胞膜棕黄着色，其阳性率为63.5%(66/104)。

　　2.2  胃癌中P16，C?MYC和COX?2表达的相关性与临床病理（表1）  P16的表达在胃癌中与不同的浸润深度，淋巴结有无转移，TNM分期，不同组织学类型均有显著差异(P＜0.05)；C?MYC的表达在胃癌中与不同的浸润深度，淋巴结有无转移，TNM分期有显著差异(P＜0.05)，而与不同组织学类型无统计学差别(P＞0.05)；COX?2的表达在胃癌中与淋巴结有无转移，TNM分期，不同组织学类型均有显著差异(P＜0.05)，而与不同的浸润深度无统计学差别(P＞0.05)。而它们与肿瘤患者年龄，性别均无统计学差异(P＞0.05)。Spearman等级相关分析结果显示P16与C?MYC、COX?2表达呈负相关(P＜0.05)，C?MYC与COX?2表达呈正相关(P＜0.05)。

　　2.3  Kaplan?Meier生存分析  单因素分析胃癌组织中P16，C?MYC和COX?2表达对预后的影响，分别将P16，C?MYC和COX?2表达分阳性组和阴性组，制出Kaplan?Meier生存曲线，进行Log?rank时序检验。单因素分析结果显示P16高表达组生存时间为(34.54±24.42)月，显著高于低表达组(26.94±22.34)月(P＜0.05)；而C?MYC和COX?2高表达组5年生存率分别为(24.33±19.46)月、(23.83±20.01)月显著低于低表达组(35.77±25.20)月、(35.97±25.37)月(P＜0.05)。

　　2.4  Cox多因素回归分析  Cox多因素分析表明P16、C?MYC和COX?2的表达，浸润深度、TNM分期、和淋巴结转移是影响患者生存时间的重要因素，而年龄、性别及组织学类型对生存时间无明显影响。其中P16阳性表达的风险比为0.60(95%可信区间为0.366～0.995，P＜0.05)；其中C?MYC阳性表达的风险比为1.75(95%可信区间为1.100～2.794，P＜0.05)；其中COX?2阳性表达的风险比为1.92(95%可信区间为1.176～3.132，P＜0.05)。

　　3  讨论
       
　　p16蛋白是一种周期蛋白依赖性激酶抑制因子，它通过阻止细胞由G1期进入S期，直接抑制细胞增殖。当P16基因发生突变、缺失时，p16蛋白不能正常表达，使细胞增殖失控，发生癌变［2］。通过本实验提示P16基因缺失或异常表达是胃癌发生过程中一个早期事件，决定了肿瘤细胞的侵袭能力，与上皮内发生的癌变能否突破各层组织有直接关系。根据随访术后患者生存期资料，P16也是也是影响患者预后的一个重要指标，是一个重要的胃癌抑制基因。
       
　　C?myc蛋白可促进细胞增殖,永生化、去分化和转化等，在多种肿瘤形成过程中处于重要地位［3］。本组实验提示在胃黏膜的癌变过程中C?MYC基因可能被激活，C?MYC基因参与了胃癌的发生及。C?MYC高表达的患者肿瘤恶性程度高，转移能力强，表明在胃癌的发生及发展过程中，C?myc蛋白的主要作用是促进细胞增殖与去分化，凋亡作用不明显。虽然胃癌的病理组织类型与C?MYC无明显关系（P＞0.05），但多因素分析表明胃癌的组织类型并不是影响预后的一个重要指标（P＞0.05）。
       
　　环氧化酶(cyclooxygenase,COX)又称前列腺素内过氧化物合成酶(PGHS)，是前列腺素(PGs)合成过程中一个主要的限速酶。本研究提示COX?2蛋白的高表达是一个晚期事件，不影响肿瘤细胞的侵袭能力，但与转移能力密切相关。高表达COX?2的患者生存时间短，肿瘤转移几率高，临床分期晚，因此COX?2可以作为预测胃癌患者预后的分子学指标。
       
　　通过本组实验，我们发现P16做为抑癌基因与癌基因C?MYC、COX?2在胃癌中的表达是呈负相关的，而后两者之间是正相关的，提示我们联合检测三种基因对预测胃癌的各种生物学行为及患者的预后比检测单一基因更有优势，能够为胃癌的基因诊断和提供更加全面、详实的资料。

【】
  ［1］ 陈灏珠,廖履坦,杨秉辉，等.实用内［M］.北京：人民卫生出版社，2006:1882?1883.

　　［2］ Gunther T，Schneider?Stock R，Pross M，et al.A lterations of the P16 MTSI?tumor suppressor gene in gastric cancer ［J］.Pathol Res Pract，1998，194(12):809?813.

　　［3］ Vita M，Henriksson M.The Myc oncoprotein as a therapeutic target for human cancer ［J］.Semin Cancer Biol，2006，16:318?330.