丹参酮ⅡA对人胃癌MKN?45细胞增殖及基质金属蛋白酶?2表达的影响
【摘要】 目的］通过观察丹参酮ⅡA对人胃癌MKN?45细胞的抑制作用及对转移相关基因MMP?2表达的影响，探讨其抗肿瘤的机制。［方法］MTT法检测不同浓度丹参酮ⅡA作用下，体外培养的MKN?45细胞的增殖情况； RT?PCR法、酶谱分析法检测MKN?45细胞MMP?2 mRNA及蛋白的表达。［结果］丹参酮ⅡA各浓度组对肿瘤细胞增殖的抑制率与阴性对照组相比，有显著差异（P<0.05），相关回归分析表明24h、48h、72h的半数抑制浓度分别为42.5μg /ml、19.4μg /ml和7.4μg /ml。PCR半定量分析发现：丹参酮ⅡA各组的MMP?2 mRNA表达均受到抑制，抑制程度随着药物浓度的增加而增加，酶谱分析法显示：丹参酮ⅡA能降低胃癌MKN?45细胞的MMP?2蛋白表达，其作用呈剂量?效应正相关，与阴性对照组相比，差异有显著性（P<0.05）。［结论］丹参酮ⅡA能有效抑制胃癌MKN?45细胞的生长，并具有明显的时间和剂量依赖性。丹参酮ⅡA可能通过抑制胃癌MKN?45细胞MMP?2 mRNA的转录下调MMP?2蛋白的表达，进而抑制肿瘤增殖。
【关键词】 丹参酮ⅡA；胃癌；抑制率；基质金属蛋白酶?2
Abstract：［Objective］ To determine the anti?tumor mechanism of TanshinoneⅡA on human Gastric Carcinoma Cell Line MKN?45.［Methods］MKN?45 cells were routinely cultured in vitro.The MTT assay had been developed for quantitative evaluation of the proliferation of MKN?45 cells of each group.Expression of MMP?2 mRNA was measured by RT?PCR and Zymography.［Results］ The difference of inhibition rates（IR） on Cell Line MKN?45 between the negative and TanⅡA group was significant（P<0.05）.The expression of MMP?2 mRNA of TanshinoneⅡA groups（3,6,9,12μg/ml） was lower than that of the negative group,statistical difference between the groups above was significant（P<0.05）,except for the 3μg/ml one.［Conclusions］ TanshinoneⅡA inhibits the growth of Cell Line MKN?45 in a dose and time?dependent manner,which may be realized through downregulating the expression of MMP?2.
Key words：TanshinoneⅡA;gastric carcinoma;inhibiting rates;matrix metalloproteinases?2
丹参酮ⅡA是活血化瘀类中药丹参的有效成分之一，具有明显的抗炎、抗氧化、调节免疫的作用，医学关于丹参酮抗肿瘤活性的研究相当活跃。本文检测丹参酮ⅡA对人胃癌MKN?45细胞增殖及基质金属蛋白酶?2表达的影响，从分子生物学角度研究丹参酮ⅡA对胃癌的影响及机制。
1 材料与方法
1.1 肿瘤细胞株及培养条件 人胃癌MKN?45细胞在含100u/ml青霉素、100u/ml链霉素、10%胎牛血清的RPMI?1640培养液中，37℃、5% CO2条件下培养，取对数生长期细胞进行实验。
1.2 实验试剂及药物 丹参酮ⅡA纯品由药品生物制品鉴定所生产。引物根据Primer Premier 5.0软件设计，β?actin上游引物：5’ATGCCATCCTGCGTCTG 3’，下游引物：5’GGACTCA TCGTACTCCTGCT3’；MMP?2上游引物5’ ACCTGGATGCCGTCGTGGA C3’，下游引物：5’TGTGGCAGCACCAGGGCAGC3’。
1.3 实验方法
1.3.1 MTT法 指数生长期的MKN?45细胞，按每孔1×104密度接种于96孔板，每孔补足RPMI1640培养液至200μl。另设只加培养液的阴性对照孔和阳性对照孔（顺铂2.5μg/ml）。过12h待细胞贴壁良好后，分别加入不同浓度丹参酮ⅡA干预，使终浓度为64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml。每个浓度设5个复孔。于加药24h、48h、72h后分别取样终止培养，每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl，37℃孵育4h，弃孔内上清液后加入二甲亚砜（DMSO）150μl，振荡10min。最后570nm波长下，酶标仪检测各孔吸光值，并减去空白对照组吸光值。细胞抑制率=（1－实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100%。剂量和效应关系用直线回归分析和相关分析，结合对数机率单位法求 IC50。
1.3.2 RT?PCR法 50ml的培养瓶中装10ml培养液培养人胃癌MKN?45细胞，细胞浓度为9×104/ml，24h后，分别用3μg/ml、6μg/ml、9μg/ml、12 μg/ml丹参酮ⅡA处理，同时设阳性对照组（0.5μg/ml顺铂）和阴性对照组（0μg/ml），培养24h、48h后，Trizol法提取RNA，以β?actin基因为内参用Taq DNA Polymerase（5u/μl）扩增。增产物取5μl在1.2%琼脂糖（含EB 0.5ng/ml）上电泳，吸光度扫描仪扫描后PCR条带用软件进行定量分析，基因的表达量用β?actin内参进行标准化，重复3次，取平均值。
1.3.3 酶谱分析法 50ml的培养瓶中装10ml培养液培养胃癌MKN?45细胞，细胞浓度为9×104/ml，24h后，用3μg/ml、6μg/ml、9μg/ml、12 μg/ml丹参酮ⅡA、阳性对照组（0.5μg/ml顺铂）和阴性对照组（0μg/ml）处理，继续培养24h，消化离心后收集细胞上清液,800 r/min离心1 min去除细胞碎片后进行SDS?PAGE电泳,其中分离胶含1 g/L的明胶。电泳结束后将凝胶置于洗脱液［2.5%Triton—100ok（5mlTriton—100溶于195mlddH2O中）］室温洗2次,30 min/次;接着将凝胶置于孵育液〔Tris?HCl 50 mmol/L（pH 7.5）,CaCl2 10 mmol/L,NaN3（叠氮化钠）0.2 g/L〕37℃孵育24 h以上;考马斯亮蓝染色,脱色液脱色至蓝色背景上出现透亮带。经天能GIS凝胶图像处理系统图像处理，分析蛋白表达量。
1.4 统计学处理 采用SPSS13.0软件包统计。采用方差分析（F检验、多样本均数间多重比较的q检验及t检验）进行处理。
2 结果
2.1 丹参酮ⅡA对胃癌MKN?45细胞增殖的影响 与对照组比较，MTT实验组细胞的吸光度值呈下降趋势，并随药物浓度的增高和作用时间的延长，下降越明显。丹参酮ⅡA组肿瘤细胞增殖的24h、48h、72h抑制率，与阴性对照组相比，均有显著差异（P< 0.05）。相关回归分析显示24h、48h、72h的半数抑制浓度分别为42.5μg/ml、19.4μg/ml、7.4μg/ml，表明丹参酮ⅡA对MKN?45细胞具有明显的生长抑制作用，并且随着药物浓度的增高和作用时间的延长，其生长抑制作用亦增强（见表1）。
表1 丹参酮ⅡA对胃癌MKN?45细胞的生长抑制作用（略）
与阴性组比较：*P<0.05
2.2 丹参酮ⅡA对人胃癌MKN?45细胞MMP?2 mRNA表达的的影响 PCR半定量结果显示：MMP?2mRNA的表达受丹参酮ⅡA抑制，且抑制程度随药物浓度的增加而增加，除3μg/ml浓度组外，丹参酮ⅡA各组与阴性组相比，差异均有显著性（P<0.05）；说明丹参酮ⅡA对胃癌MKN?45细胞作用可能与诱导下调MMP?2mRNA表达有关（表2、图1、2）。
表2 丹参酮ⅡA对胃癌MKN?45细胞MMP?7mRNA表达的影响（略）
与阴性组比较，*P<0.05
图1 24h MMP?2 mRNA 表达电泳图（略）
从左到右分别为Marker、阳性对照、阴性对照、3、6、9、12（μg/ml）丹参酮ⅡA组
图2 48h MMP?2mRNA表达电泳图（略）
从左到右分别为Marker、阳性对照、阴性对照、丹参酮ⅡA3、6、9、12（μg/ml）组
2.3 酶谱分析测丹参酮ⅡA对人胃癌MKN?45细胞MMP?2蛋白表达的影响 MMP?2为位于蓝色背景上的透亮带，经反转模式显示。酶谱分析表明丹参酮ⅡA能抑制胃癌MKN?45细胞的MMP?2蛋白表达，其作用呈剂量-效应正相关。各丹参酮ⅡA处理组的MMP?2表达量均低于阴性对照组，差异有统计学意义（P<0.05）； 9μg/ml、12μg/ml丹参酮ⅡA组、阳性对照组与3μg/ml丹参酮ⅡA组相比，MMP?2表达差异均有统计学意义（P<0.05）；随着丹参酮ⅡA（6μg/ml、9μg/ml、12μg/ml）浓度的上升，MMP?2蛋白表达量虽有下降，但差异不显著（P>0.05），见表3、图3、图4。
表3 丹参酮ⅡA对胃癌MKN?45细胞MMP?2蛋白的表达（略）
与阴性组比较，*P<0.05
图3 MMP?2 蛋白表达（略）
从左到右分别为阴性、丹参酮ⅡA 3、6、9、12（μg/ml）、阳性组
图4 MMP?2蛋白表达电泳图（略）
从左到右分别为阴性组、3、6、9、12（μg/ml）丹参酮ⅡA组
3 讨论
活血化瘀中药丹参的功效在《神农本草经》中记载它能“破癥除瘕”，丹参酮ⅡA是丹参中提取的脂溶性有效成分之一，其分子式中菲环可结合DNA，呋喃环和醌类结构而产生自由基，引起DNA损伤而抑制肿瘤细胞合成DNA。研究表明TanⅡA对乳腺癌、淋巴细胞白血病、鼻咽癌在内的多种肿瘤细胞有抑制作用。姬郁林［1］发现TanⅡA能上调p53、p21、Fas、bax，下调CDKN2等凋亡相关基因表达，将细胞周期阻滞于G0/G1期，干扰DNA合成而产生抗肿瘤作用。陈坚［2］等认为TanⅡA在一定浓度范围内呈时间依赖性及剂量依赖性地诱导SGC7901胃癌细胞坏死及凋亡，机制与P53表达上调有关。
MMP?2是一种依赖锌离子的蛋白水解酶，主要底物是IV型胶原和明胶。激活后降解细胞外基质（ECM），在肿瘤突破基底膜屏障、促进血管生成及浸润过程中发挥重要作用，其高表达同多种实体瘤的转移相关［3］。MMP?2在正常胃组织中表达阴性，癌旁组织中呈低表达，而胃癌组织阳性表达率达85.1%［4］。Mortig ［5］等观察114例胃癌患者，其中93例癌组织MMP?2表达阳性，表达强度与胃癌的浸润深度、进展分期及淋巴结转移有关。Ji［6］等认为MMP?2在进展期胃癌表达高于早期胃癌，有淋巴结转移或弥漫型生长表达率也显著增高。
本研究显示丹参酮ⅡA能显著降低人胃癌MKN?45细胞的 MMP?2 mRNA及蛋白表达，效果随药物浓度的增加而提高。丹参酮ⅡA以时间和剂量依赖的方式抑制人胃癌MKN?45细胞的增殖，机制可能与其下调MMP?2 mRNA的转录和蛋白表达有关。丹参酮ⅡA作为一种低毒有效的中药活性成分，在胃癌的上具有其可行性和优越性，值得进一步研究和开发。
【】
［1］ 姬郁林.丹参酮对人肺癌细胞株的抑制作用及其分子机理［J］.肺癌杂志,2008,2（11）:202?205.
［2］ 陈坚.丹参酮ⅡA诱导SGC7901胃癌细胞凋亡及机制［J］.复旦学报（医学版）,2007,34（1）:57?65.
［3］ Bae IH,ParkMJ,Yoon SH,et al.Bcl?w promotes gastric cancer cell in?vasion by inducing matrix metalloproteinase?2 expression via phosphoinositide?3?kinase,Akt,and Sp1［J］.Cancer Res,2006,66（10）:4991?4995.
［4］ 潘留兰.MMP?2、MMP?7蛋白在胃癌组织中表达的意义［J］.中国实验诊断学,2007,11（1）:84?86.
［5］ Monig SP,Baldus SE,Hennecken JK,et a1.Expression of MMP?2 is associated with progression and lymph node metastasis of gastriccarcinoma［J］.Histopathology,2001,39（6）:597.
［6］ Ji F,Chen YL,Jin EY,et al.Relationship between matrix metalloproteinase?2 mRNA expression and clinicopathological and uro?kinase?type plasminogen activator system parameters and prognosis in human gastric cancer［J］.World Gastroenterol,2005,11:3222?3226.
