从纤支镜刷落细胞提取微量RNA并检测Foxp3基因表达

【摘要】  目的　建立纤维支气管镜刷落细胞提取微量核糖核酸（RNA）的方法，检测分析调节性T细胞（Treg）Foxp3基因在肺癌及肺良性疾病患者中的表达水平。方法　以磁珠吸附法提取154例肺癌及肺良性疾病患者纤支镜刷脱细胞的微量RNA，以实时荧光定量RT-PCR的方法检测Treg特异性转录因子Foxp3基因在肺癌及肺良性疾病患者中的表达水平。结果 平均总RNA提取量为5.08μgRNA/例，最低为3.20μg，最高为15.25μg。肺癌患者组中Foxp3 mRNA的表达水平（0.0000~13682.0805，四分位数间距0.0011）显著高于肺良性疾病组（0.0000~0.0061，四分位数间距0.0000）（Z=－3.508, P＜0.01），肺癌患者组中Foxp3的阳性率（29.34%，27/92）亦明显高于肺良性疾病组（3.23%，2/62） （χ2=16.535，P＜0.01）。结论 利用纤支镜毛刷刷取病灶部位涂片后毛刷中的剩余细胞，采用磁珠吸附的方法可以提取微量RNA，并用于基因表达水平的检测。

【关键词】  纤维支气管镜 刷落细胞 微量RNA提取 Foxp3

    [Ａｂｓｔｒａｃｔ]   Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ   To setup protocol for RNA isolation from bronchofibroscopic brush-off cells and analyze the expression of Foxp3 in samples of lung carcinoma and benign disease patients. Methods  Total RNA was isolated from bronchofibroscopic brush-off cell samples of 154 patients with lung carcinoma and benign lung diseases by magnetic-bead total RNA isolation method. Real-time fluorescent quantitative RT-PCR was used to detect the expression of Treg-specific transcription factor Foxp3. Results  The mean yield of total RNA was 5.08μg/sample, with the lowest as of 3.20μg/sample and the highest as of 15.25μg/sample. The expression level of Foxp3 in lung cancer patient samples (0.0000~13682.0805, interquartile range 0.0011) was significantly higher than that in benign disease samples (0.0000~0.0061, interquartile range 0.0000) (Z=-3.508, P＜0.01), and the positive rate of Foxp3 in lung cancer patient samples (29.34%, 27/92) was also higher that that in benign disease samples (3.23%, 2/62)(χ2=16.535, P＜0.01). Conclusions   Total RNA can be isolated from bronchofibroscopic brush-off cells by magnetic-bead method and used for further detection of gene expression.

    [Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ]  ibronchofibroscope;　brushing-off cell;　RNA isolation;　Foxp3

    肺癌是我国发病率较高的肿瘤之一，对临床标本进行基因检测有利于肺癌的诊断、方案制订及预后判断。纤维支气管镜术是临床上对肺部疾病患者常用的检查方法，我们利用纤维支气管镜毛刷刷取病变部位涂片后毛刷中剩余的刷落细胞，共收集154例肺癌及肺良性疾病患者的刷落细胞样本，建立了提取微量RNA的方法，并检测分析其中与肿瘤生长密切相关的CD4+CD25high Treg细胞[1]特征性标记Foxp3 mRNA的表达水平。

    1　资料与方法

    1.1　一般资料　标本来源：154例纤维支气管镜刷落细胞标本均取自于2006年4月至2007年5月邵逸夫（门诊和住院患者）内镜室，所有标本均经刷落细胞和组织病检查，其中肺癌92例，肺良性疾病62例。

    1.2　主要试剂和仪器　总RNA纯化试剂盒Maga- Bio（BSC53S2）、逆转录酶、Taq酶等，均购自杭州博日科技有限公司。Foxp3上下游引物序列[2]分别为5'-GAGAAGCTGAGTGCCATGCA-3'和5'-AGGAG-CCCTTGTCGGATGAT-3'，探针序列为FAM-5'-CACAGATGAAGCCTTGGTCAGTGCCA-3' -TAMRA  GAPDH上下游引物序列分别为5'- CTTAGCACC-CCTGGCCAAG -3'和5'-GATGTTCTGGAGAGC-CCCG-3'，探针序列为FAM-5'-CATGCCATCACT-GCCACCCAGAAGA-3'-TAMRA，均由上海英骏公司合成。Line-Gene荧光定量PCR检测系统（杭州博日科技有限公司），全波长紫外分光光度计（HP 8453美国），低温高速离心机（HERAEUS D-37520 德国）。

    1.3　方法 

    1.3.1　标本的收集与保存　将纤维支气管镜毛刷刷取病变部位涂片后毛刷中剩余的细胞洗脱于装有1ml无菌0.9%氯化纳溶液的离心管内（存放于冰上），4℃ 7 000转/min离心7min，弃上清，打散沉淀，加入100μl无菌0.9%氯化纳溶液-80℃保存。

    1.3.2　洗脱细胞总RNA提取及浓度和纯度的鉴定   取保存于-80℃中纤维支气管镜洗脱细胞，加Lysis  buffer 100μl和PK酶 10μl，振荡混合15s，置56℃水浴10min，取出后，加Binding buffer 250μl及磁珠10μl轻柔混合，室温放置10min，将已吸附RNA的磁珠管放置在磁架中，静置3min后轻轻吸弃上清（保留磁珠），加Wash buffer 500μl混匀（漂洗磁珠），再放入磁架中吸附磁珠后吸弃上清（此步骤重复3次），最后一次完全吸弃上清后加入Elution buffer 20μl，混匀置室温10min，后置冰上1h，再放入磁架，静置3min（洗脱磁珠上结合的RNA），吸取已含有总RNA的Elution buffer保存于-80℃，同时将所提取的总RNA在紫外分光光度计上测定260nm紫外光吸收，分析其浓度。

    1.3.3　RT-PCR实时荧光定量法检测　（1）取2μg总RNA逆转录合成cDNA：取保存于-80℃中的RNA 25μl进行逆转录。反应体系：①18μl RNA，1μl Olig(d)t18, 70℃放置5min后立即冰浴；②2.5μl 10×AMV buffer，1μl AMV，1μl RNasin，1.5μldNTP，42℃放置30min；（2）PCR扩增：分别采用Foxp3及内参照GAPDH两对引物和探进行PCR扩增。反应体系：5μl 10×PCR buffer ,3μl MgCl2，上、下游引物各2μl（10pm/μl），5μl 探针，1μl dNTP，0.5μlTag酶（5μ/μl），29.5μl水H2O，cDNA各2μl。反应条件：95℃ 5min预变性，95℃ 20s、62℃ 20s、72℃ 20s共40个循环，72℃10min延伸，荧光定量PCR仪自动记录。

    1.3.4　实时荧光定量PCR数据分析　标本中被检测基因的相对含量利用下列公式：被检测基因的相对含量＝2-△CT，其中△CT= CT（Foxp3）-CT (GAPDH) [3]。

    1.4　统计学方法　采用SPSS11.5软件进行统计学分析，Mann-Whitney方法分析Foxp3相对表达水平的差异，Pearson Chi-Square方法分析Foxp3阳性率的差异，设P＜0.01为差异有统计学意义。

    2　结果

    2.1　纤支镜毛刷洗脱细胞镜检　洗脱细胞涂片经HE、姬目萨染色，可见少量淋巴细胞及肿瘤细胞（见封二图1、2）。

    2.2　RNA的浓度和鉴定　毛刷洗脱细胞采用磁珠吸附法提取总RNA，在紫外分光光度计上测定260 nm紫外光吸收，分析其浓度，结果154例标本平均总RNA提取量5.08 μgRNA/例，最低为3.20μg，最高为15.25μg，均达到进一步检测要求。

    2.3　总RNA质量的鉴定　取1μg逆转录合成cDNA，采用内参照GAPDH进行PCR扩增，扩增片段为151bp（图1），经1.5%的琼脂糖电泳鉴定，图中扩增条带清晰可见，表明提取的RNA可用于RT-PCR检测。

    2.4　Foxp3基因在肺癌、肺良性疾病中表达水平：经实时荧光定量RT-PCR检测，92例肺癌纤支镜刷落细胞Foxp3 mRNA表达水平（相对表达量=2-△CT）（相对表达量范围0.0000~13682.0805，四分位数间距0.0011），与62例肺良性疾病患者Foxp3 mRNA表达水平（相对表达量范围0.0000~0.0061，四分位数间距0.0000），差异有统计学意义（Z=－3.508, P＜0.01）。

    2.5　肺癌、肺良性疾病中Foxp3基因阳性分布　　以CT值≤35为阳性界值，肺癌组中的阳性率为29.34 %（27/92），肺良性疾病组为3.23 %（2/62）（χ2=16.535，P＜0.01）。肺癌组中不同病理类型的阳性检出率分别为：小细胞肺癌40.00 %（6/15）、非小细胞肺癌27.27%（21/77）(χ2=0.981，P＞0.05)。

    3　讨论

     肺癌是当今世界各国常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在男性均占第一位，在女性发病率占第二位，而死亡率占第一位，主要原因是确诊为肺癌的患者中多数已为进展期，丧失了有效的手术机会，因此早期诊断是提高肺癌5年生存率的关键[4]。

    　　病是肺癌确诊的金标准，而纤支镜检查是临床确诊肺癌时的主要检查方法之一[5]，从病灶部位刷取刷落细胞或活检组织进行的病理学检查能大大提高肺癌的诊断率。为利用纤维支气管镜刷落细胞、淋巴穿刺和支气管肺泡灌洗液等临床微量标本进行回顾性研究进一步提高肺癌的检出率, 作者建立了纤维支气管镜刷落细胞提取微量RNA方法, 并检测Foxp3基因表达。

    　　调节性T细胞（CD4+CD25high Foxp3+Treg）是近年来确定的一类具有免疫功能的T细胞亚群，在维持机体免疫自稳、调控免疫应答方面起重要作用[7、8]。近几年研究发现Foxp3基因高表达于淋巴细胞，尤其特异性地表达于CD4+ T细胞亚群，是CD4+ CD25+ Treg细胞的一个特征性的标志。目前检测Foxp3的方法主要有流式细胞术、RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR等，流式细胞术的方法对标本的需要量比较多，常用于外周血和手术组织的检测。

    　　本次研究收集154例纤维支气管镜刷脱细胞，应用实时荧光定量RT-PCR检测分析调节性T细胞（Treg）Foxp3基因在肺癌及肺良性疾病患者中的表达水平。实验结果表明，肺癌组刷落细胞中Foxp3 mRNA的相对表达水平量明显高于肺良性疾病组 （P ＜0.01 ）。 以CT值≤35为阳性界值，肺癌组中的阳性检出率为29.34%（27/92），其中小细胞肺癌40.00%（6/15），非小细胞肺癌27.27%（21/77），两组之间差异无统计学意义。纤支镜刷落细胞病理学检查结果显示，小细胞肺癌的病理阳性检出率为57.14%（44/77），非小细胞肺癌为60.00%（9/15），综合分析纤支镜刷落细胞病理学检查和Foxp3 mRNA表达的结果，发现小细胞肺癌的阳性检出率可提高为73.33%（11/15）， 非小细胞肺癌为67.53%（52/77），Foxp3基因的高表达在一定程度上将有助于肺癌的检出。有文章报道CD4+ CD25+ Treg细胞在肺癌的肿瘤组织中有明显增加，Treg细胞可通过抑制或杀伤效应性CD8+ 或CD4+ T细胞达到抑制机体的抗肿瘤免疫的作用， 如果能同时检测肺癌患者的外周血或肿瘤组织（浸润淋巴细胞）中CD4+ CD25 high Foxp3+ Treg的分布，将更有助于观察肿瘤患者的预后及个体生物（免疫）治疗方案的制定[8，9]。

    　　随着分子生物学技术的以及人们对肿瘤相关基因研究的进展，实时荧光定量RT-PCR技术常被用于异常表达基因的检测和定量。实时荧光定量RT-PCR是对探针和模板的特异性杂交时释放荧光信号的检测，并根据扩增产物的荧光信号出反应体系中靶基因初始模板数。这种检测手段具有快速、敏感、精确及重复性好的特点，这些特点为临床微量标本在基因水平的检测提供了可靠的依据[10]。利用临床检查中剩余的标本，采用不同的方法进行多项指标的联合检测，结合临床做出客观评价，将有利于提高肺癌的检出率，为肺癌的筛查和早期诊断提供了一定的理论。

【参考】
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3 陈嘉, 杨蓓蓓, 张行, 等. 喉癌组织中表皮生长因子受体 mRNA含量测定[J]. 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2006, 41（10）:777-781.

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11 严玉兰, 郑金旭, 王绪, 等. 肺癌纤维支气管镜刷落标本端粒酶活性检测[J]. 癌症, 2002, 21（7）：768-771.

12 张行, 张敷标, 周畔, 等. 纤维支气管镜毛刷洗脱细胞中CEA mRNA、CK20mRNA表达的临床意义[J]. 全科医学临床与教育, 2007, 5（5）：363-365.

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