罗格列酮对糖尿病大鼠肺炎性病变的影响

              作者：吴晖　朱有法　陆颖理　庞玉萍　王国兴 赵江波 王舟 李红

【摘要】  目的　观察过氧化物酶体增殖体活化受体-r (PPAR-r)激动剂罗格列酮对链脲菌素诱导的糖尿病大鼠肺部炎性病变的影响。方法 30只10周龄SD大鼠随机分为正常对照组（C组，雌雄各5只）、糖尿病模型组（D组，雌雄各5只）、糖尿病罗格列酮处理组（DR组，雌雄各5只），采用链脲菌素诱导建立10周糖尿病大鼠模型。其中糖尿病罗格列酮处理组用马来酸罗格列酮1mg．kg-1．ｄ-1灌胃，对照组及糖尿病模型组用同体积0.9％氯化钠注射液代替。模型建立10周后，全部大鼠于氯胺酮35mg/kg和苯巴比妥50mg/kg腹腔内注射麻醉处死，并取肺组织。光学显微镜下观察肺组织炎症程度、检测杯状细胞的分布，免疫组织化学方法检测肺组织TNF-α表达的阳性面积百分比与平均积分光密度值（IOD）。结果 ①肺部炎症观察：大多数正常对照组大鼠肺组织内未见炎症细胞。糖尿病模型组可见片状炎症细胞聚集，局部肺泡结构消失。罗格列酮处理组糖尿病大鼠肺组织炎症明显比模型组轻；②杯状细胞观察：在AB/PAS染色下，正常对照组大鼠各级气管上皮内均未见杯状细胞出现，糖尿病模型组在一级或二级支气管内出现较多的杯状细胞。罗格列酮处理组糖尿病大鼠在一级或二级支气管内也出现杯状细胞，但数量明显少于糖尿病模型组；③TNF-α的表达:TNF-α主要表达于气管、血管周围的成纤维细胞内，糖尿病模型组、罗格列酮处理组还可见巨噬细胞胞浆内阳性表达。正常对照组肺组织阳性表达较其余两组弱，罗格列酮处理组阳性面积百分比及平均积分光密度值介于正常对照组和糖尿病模型组之间[其中阳性面积百分比（%）C∶D∶DR组为9.07±4.17vs23.75±5.66vs12.21±1.50(F=54.5,P＜0.05；平均光密度C∶D∶DR组为0.60±0.03vs0.73±0.08vs0.66±0.04(F=22.73，P＜0.05）]，差异有统计学意义。结论 高血糖能引起肺部炎症及组织结构的破坏。罗格列酮能够保护糖尿病大鼠肺组织，该作用独立于降血糖之外。

【关键词】  糖尿病； 实验性；　肺；　炎症；　肿瘤坏死因子；　罗格列酮

    Ａｂｓｔｒａｃｔ    Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ   To investigate the effect of rosiglitazone on pulmonary inflammation in streptozocin-induced diabetic rats . Methods  30 S-D rats were divided into three group: control group(C,n=10), diabetic group(D, n=10) and rosiglitazone treated group(DR, n=10). After 10 weeks,all the rats were sacrificed and their lungs were taken out to sudy. The pulmonary inflammation degree and beaker cells in each group were observed through light microscope. At the same time, the expression of the tumor necrosis factor-α(including ratio of the positive area and integral optical density value )in the pulmonary tissue of each group was detected by immunohistochemistry. Results  There were foliated inflammatory cells aggregation in the lung of the diabetic group and some alveolus construction disappeared. The pulmonary inflammation in the rosiglitazone treated group was obviously attenuated compared with the diabetic group. There were no beaker cells appeared in the tracheal epithelium in the control group.

    There were many beaker cells appeared in the first class or second class in the endotracheal of the diabetic group. There were less beaker cells appeared in the first class or second class in the endotracheal of the rosiglitazone treated group compared with the  过氧化物酶体增殖体活化受体-r（peroxisome proliferator-activated receptor-r，PPAR-r）是核受体超家族成员之一。近来研究发现PPAR-r在肺组织细胞也有表达，PPAR-r激动剂在哮喘[1]、慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases, COPD）[2]、肺纤维化[3]以及急性呼吸窘迫综合征[4]等一系列呼吸道疾病中，具有改善、减轻肺部炎性病变的作用。但目前尚未见到PPAR-r激动剂对糖尿病大鼠肺部病变影响的相关报道。罗格列酮（rosiglitazone）是一种PPAR-r强效、高选择性的激动剂，本次研究以罗格列酮灌胃治疗糖尿病大鼠模型，观察PPAR-r对糖尿病大鼠肺部炎性病变的影响。

    1　材料和方法

    1.1　实验动物及分组　2007年9月至12月选择10周龄Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，雌雄各半；平均体重(313.97±33.77)g， 平均血糖(96.06±4.86) mg/L，由浙江省医学院动物中心提供。将大鼠分为正常对照组（C组，雌雄各5只）、糖尿病模型组（D组，雌雄各5只）、糖尿病罗格列酮处理组（DR组，雌雄各5只）。

    1．2　模型的构建　所有大鼠在清洁性（二级）条件下饲养，室内温度为15℃～25℃，自由摄食及饮水[5]。糖尿病模型组腹腔注射链脲菌素（由美国Sigma公司生产）60mg/kg(溶于0.1mol/L pH4.5枸橼酸钠缓冲液)，血糖≥16.1mmol/L为造模成功。糖尿病罗格列酮处理组用马来酸罗格列酮（由天津葛兰素史克公司生产）1mg·kg-1·ｄ-1以0.9％氯化钠注射液溶解后灌胃。正常对照组及糖尿病模型组用同体积0.9％氯化钠注射液代替。

    1．3　标本采集和处理　模型建立10周后，全部大鼠以氯胺酮35mg/kg和苯巴比妥50mg/kg腹腔内注射麻醉后，打开大鼠胸腔，右肺注入4％甲醛溶液3mL作内固定后摘下保存于4％甲醛溶液内48h，取材后经梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片5μm，行HE、AB/PAS及免疫组织化学染色。

    1．4　检测指标

    1．4．1　炎症程度检测　在HE染色切片上，阅读整张切片，根据炎症细胞的多少（主要观察淋巴细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞）进行定级。-: 肺间质无炎性细胞出现或散在少量炎症细胞；+: 肺间质有较多的炎性细胞浸润，在气管、血管周围可见炎症细胞呈小灶性聚集；+++: 炎性细胞密集，成片状分布，炎性细胞聚集处肺泡结构消失；++: 炎性细胞浸润程度介于+与+++之间。

    1．4．2　杯状细胞检测　在AB/PAS(爱尔新蓝/过碘酸雪夫试剂)染色切片上，阅读整张切片，根据杯状细胞出现的部位及数量进行定级。-: 肺内各级支气管均无杯状细胞出现；+：在一级支气管上皮内出现杯状细胞，数量占支气管上皮的1％～10％； ++： 在二级支气管上皮内出现1％～10％或在一级支气管上皮内出现11％～50％的杯状细胞；+++：杯状细胞在细支气管出现或在二级支气管上皮内出现11％以上或在一级支气管上皮内出现51％以上。

    1．4．3　TNF-α免疫组织化学染色　采用Envision二步法。一抗兔抗大鼠TNF-α多克隆抗体（由武汉博士德生物工程有限公司生产）； Envision试剂（由DAKO公司生产）。石蜡切片脱蜡至水，3％过氧化氢溶液-甲醇去除内源性过氧化物酶，0.01mmol/L枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)煮沸行抗原修复。1：50 TNF-α多克隆抗体4℃冰箱孵育过夜（阴性用PBS代替）。滴加Envision工作液，37℃孵育20min，DAB显色，苏木精复染，脱水，封片。阳性部位显示为棕黄色。

    1．4．4　图像定量分析　应用高清晰彩色病理图像免疫组化测量系统进行免疫组化图像分析，经标准灰度校正后，随机取5个视野，测定TNF-α的阳性面积百分比（1个视野=83723856μm2）与平均积分光密度值（integrated optical density values，IOD）。Leica DMLB显微镜（由德国Leica公司生产）；分析软件：Leica Qwin Standard V2.8。

    1．5　统计学分析　采用SPSS11.5统计学软件。计量数据以均数±标准差(■)表示。计量数据行单因素方差分析；等级资料采用秩和检验。设P＜0.05为差异有统计学意义。

    2　结果

    2.1　大鼠一般情况　用链脲菌素诱导糖尿病大鼠模型成功后，糖尿病大鼠逐渐出现多饮、多食、多尿，体重明显减轻。糖尿病模型组（D组）因高血糖衰竭死亡一只雄性大鼠，正常对照组死亡一只雄性大鼠。实验结束时三组大鼠体重及血糖比较见表1。

     由表1可见，糖尿病模型组和罗格列酮处理组糖尿病大鼠体重均较正常对照组大鼠减轻，差异有统计学意义（F=15.82，P＜0.05）。糖尿病模型组与罗格列酮处理组血糖较正常对照组大鼠显著升高，差异有统计学意义（F=11.119，P＜0.05）。而糖尿病模型组和罗格列酮处理组血糖比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

    2．2　肺部炎症观察结果　正常对照组大鼠可见大多数大鼠肺组织内未见炎症细胞，少数切片上可见肺泡壁、血管气管周围散在淋巴细胞及中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。糖尿病模型组（D组）可见片状炎症细胞聚集，局部肺泡结构消失，见封三图7。

    　　三组光镜下肺部炎症方程比较　见表2。由表2可见，罗格列酮处理组糖尿病大鼠肺组织炎症明显比模型组轻，见封三图8。

     由表2可见，两组比较，差异有统计学意义（Z=-2.32，P＜0.05）。

    2．3　杯状细胞观察结果　在AB/PAS染色下，正常对照组大鼠各级气管上皮内均未见杯状细胞出现，糖尿病模型组在一级或二级支气管内出现较多的杯状细胞，见封三图9。罗格列酮处理组糖尿病大鼠在一级或二级支气管内也出现杯状细胞，但数量明显少于糖尿病模型组，见封三图10，三组各级气管上炎内杯状细胞比较见表3。

     由表3可见，DR组与D组比较，差异有统计学意义（Z=-2.51，P＜0.05）。

    2．4　TNF-α的表达　本次研究三组大鼠均可见TNF-α的阳性表达。TNF-α主要表达于气管、血管周围的成纤维细胞内，糖尿病模型组、罗格列酮处理组还可见巨噬细胞胞浆内阳性表达，正常对照组肺组织阳性表达较其余两组弱，且面积小，见封三图11~14。对上述切片进行免疫组化图像分析，经标准灰度校正后，随机取5个视野，测定TNF-α的阳性面积与平均积分光密度值（IDP），见表4。

     由表4可见，阳性面积百分比：三组比较，糖尿病模型组和罗格列酮处理组均较正常对照组升高（ F=54.5,P＜0.05）。平均积分光密度值, 三组比较，糖尿病模型组和罗格列酮处理组均较正常对照组升高，而罗格列酮处理组与糖尿病模型组比较，无论是阳性面积百分比还是平均积分光密度值，均较后者有明显降低（F=22.73，P＜0.05）。

    3　讨论

     糖尿病是一种以糖脂代谢紊乱为特征的疾病，其发生、与高血糖和/或高血脂所引起的炎症反应密切相关[6]。糖尿病的各种慢性并发症严重地影响着患者的生活质量，甚至直接威胁其生命。其中最重要的慢性并发症是微血管病变。眼底视网膜、肾脏、神经组织一直被认为是微血管病变的主要靶器官。但是实验性的研究显示，肺脏由于具有广泛的密集的毛细血管网，因而也是微血管病变的重要靶器官[7]。糖尿病病人相比较于健康人群，其肺功能下降，肺内气体弥散功能出现障碍，容易出现呼吸功能异常[8]。同时，高血糖能够干扰白细胞的趋化、吞噬以及活化功能，使糖尿病患者更容易引起呼吸道的炎症。因此，肺组织作为糖尿病微血管并发症的重要靶器官之一，已越来越引起重视。

     糖尿病及其并发症的发病机制相当复杂，其中免疫和炎症的病理生理变化起到重要的作用。而增加的氧化应激、高血糖、糖基化终末产物的形成等因素加重了糖尿病患者的炎症反应[9]。近来多项研究发现，炎症因子如TNF-α等在多种组织中能影响胰岛素信号传导途径，在糖尿病组织及血液中浓度增高，被认为与糖尿病发病及其并发症发生发展有密切关系[10]。

     本次研究中可以见到糖尿病大鼠的肺组织内有大量的炎症细胞浸润，类似间质性肺炎改变，炎症较重处，肺泡结构破坏，一级、二级支气管上皮内发现大量杯状细胞增生。与此同时本次研究结果发现，糖尿病大鼠肺组织炎症因子TNF-α的表达（阳性面积百分比和平均光密度）明显增强，提示高血糖可以造成大鼠肺组织的炎症性损害；而TNF-α的表达明显增强，说明糖尿病肺部病变与炎症因子尤其是TNF-α的表达有一定的关系。

     在本次研究中，经过罗格列酮灌胃的糖尿病大鼠的肺组织，不论是在炎症的程度、大气道杯状细胞的数目，还是TNF-α的表达均较糖尿病大鼠有显著的减少，说明罗格列酮能通过抑制糖尿病大鼠肺部的炎症反应，从而改善糖尿病大鼠肺组织病变。在本次研究中，糖尿病大鼠模型组与罗格列酮处理组其高血糖水平没有显著差异性，但是罗格列酮已经表现出明显的改善肺部病变的作用，也提示其改善糖尿病大鼠肺部病变的作用不依赖于降血糖作用。现有多项研究发现，罗格列酮作为一种PPAR-r强效、高选择性的激动剂，对内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞以及单核细胞等各种细胞有多种作用[11]。其除了增加胰岛素的敏感性，从而降低血糖外，尚具有抗增殖，抗炎和免疫调节作用[12，13]。在体外实验中，PPAR-r激动剂能抑制趋化因子诱导的嗜酸性粒细胞、单核巨噬细胞的趋化，也能抑制嗜酸性粒细胞依赖的细胞毒作用，同时，它还能抑制各种炎性细胞和组织细胞产生诸如细胞因子、趋化因子、粘附分子、金属蛋白酶、COX-衍生物、一氧化氮合成酶衍生物等促炎介质[14，15]，因此可以减轻炎症的病变程度，甚至阻断炎症的发生。推测本研究中，罗格列酮改善糖尿病大鼠肺部病变的机制与上述机理相一致，罗格列酮处理组大鼠的肺组织中TNF-α表达较糖尿病大鼠组明显减少即为一有力佐证。

     综上所述，高血糖能引起肺部炎症及组织结构的破坏。罗格列酮能够保护糖尿病大鼠肺组织，该作用独立于降血糖之外。

【】
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