高氧诱导新生鼠急性肺损伤模型的制备及其机制探讨

                           作者：潘佳容　肖志辉　张晨美

【摘要】  建立新生儿高氧急性肺损伤的动物模型,并探讨其发病机制。方法　采用新生Sprague-Dawley(SD)大鼠持续暴露于90％～95％的常压氧气造成高氧急性肺损伤。实验3、7d时分别检测高氧模型组和对照组支气管肺泡灌洗液(BALF)中丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶（SOD）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α)，测定肺组织核因子－κB（NF－κB）染色强度，并观察肺组织病理表现。结果　与对照组比，高氧组3d时BALF中MDA、TNF-α含量升高(t分别＝7.07、6.45，P均 <0.05)，SOD活性下降(t＝4.56，P <0.05)，肺组织NF－κB活性上升(t＝50.08，P <0.05)，肺组织见小血管扩张、充血和肺泡内少量出血及以中性粒细胞、巨噬细胞为主的炎性细胞浸润；7d时，高氧组BALF中MDA、TNF-α含量进一步升高(t分别＝9.70、7.20，P均 <0.05)，SOD活性进一步下降(t＝7.15，P <0.05)， NF－κB染色强度进一步升高(t＝98.05，P <0.05)，肺组织充血、水肿，间质内浸润的中性粒细胞、巨噬细胞等增多，肺泡间隔轻度增宽，肺组织结构紊乱。结论　新生鼠持续暴露于高浓度氧气可制备新生儿高氧急性肺损伤动物模型。高浓度氧致脂质过氧化，抗氧化酶系统活性降低，NF－κB过度活化，TNF-α过度释放，氧化/抗氧化系统失衡和过度炎症反应是肺损伤的重要发病机理。

【关键词】  高氧；　肺损伤；　疾病模型；　动物；　核因子－κB

    Ａｂｓｔｒａｃｔ    Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ   To establish an optimal animal model of oxygen－induced acute lung injury(ALI) in neonate，and to study the possible underlying mechanism. Methods 　Persistence exposure of 90％～95％ oxygen resulting in ALI was practiced in neonatal Sprague-Dawley(SD) rats. At the third day and seventh day of exposure，malondialdehyde(MDA ) ，superoxide dismutase (SOD) and TNF-αin bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were determined and the intension of nuclear factor -κB(NF -κB) expression in rat lung was analyzed by the method of immunohistochemistry，and lung histopathological changes were examined in hyperoxic group and control group. Results 　 After 3 days， compared with the control group，hyperoxic group showed ALI characterized by the increase in the concentration of MDA ， TNF-α in BALF and the intension of NF -κB in rat lung while the decrease in the activity of SOD in BALF (t＝7.07,6.45,50.08,4.56, P<0.05) and presence of congestion， edema， inflammatory infiltration. After 7 days， continuous increase

    in the concentration of MDA ， TNF-α in BALF and the intension of NF -κB in rat lung and continuous decrease in the activity of SOD in BALF  were observed(t＝9.70,7.20,98.05,7.15, P<0.05)， and lung histopathological presence showed more severe changes in hyperoxic group.　Conclusions 　 An optimal animal model of oxygen－induced ALI in neonate was established by persistence exposure of 90％～95％ oxygen with neonatal S-D rats. Excesses of lipid peroxidation， decrease of activity of antioxidase， increase of activity of NF－κB and excess release of TNF-α are associated with hyperoxia. The mechanisms of imbalance of oxidant/antioxidant and inflammation may play important roles in the development of  早在1967 年Northway就首次提出新生儿高氧性肺损伤的概念。目前在新生儿领域，高氧肺损伤愈加引起人们的重视，但是至今对于高氧肺损伤的确切机理及其干预措施仍未取得理想进展。建立一种合适的动物模型是进行高氧性肺损伤研究的前提。本次研究以新生Sprague-Dawley(SD)大鼠制备、简易、的新生儿高氧急性肺损伤动物模型,并探讨其发病机制。

    1　材料与方法

    1.1　实验动物　2005年4月至2006年1月生后3d新生SD大鼠48只,体重9.0～11.0g，平均（9.81±0.68 ）g，性别不限, 新生鼠未断奶,与哺乳母鼠共同饲养,系清洁级动物,苏州大学动物实验中心提供。

    1.2　建立高氧环境　自制25cm×25cm×35cm的有机玻璃容器，顶部一进气孔（直径0.5cm），侧面有等大的排气孔，进气孔持续通入纯氧，测氧仪（由浙江利达仪器厂生产）连续监测箱内氧浓度，使氧浓度维持在90％～95％。容器内置有饲料、水、钠石灰250g（由上海陆都化学试剂厂生产）以及垫料。环境温度22～26℃，相对湿度保持60%～70%。

    1.3　实验动物分组及处理　生后3d新生SD大鼠48只编号、称重后随机分为对照组和高氧组，每组24只。高氧组新生鼠置于上述高氧环境。对照组新生鼠则置于同一室内, 接受常压空气。高氧组每天开箱两次(更换垫料、钠石灰、水及饲料，并与空气组互换母鼠以避免母鼠因氧中毒致护理能力下降，两次开箱总时间不超过1h)。

    1.4　实验指标检测

    1.4.1　支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid  BALF )中指标检测实验3d和7d后,腹腔注射戊巴比妥钠(90mg/kg)麻醉后放血处死。经气管插管并向导管内注入4 C0.9％氯化钠注射液灌洗3 次,将灌洗液于离心半径8cm, 2 500r/min 离心10min,取上清液备测丙二醛（malondialdehyde，MDA）、总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，以及(tumor necrosis factor-α，TNF-α)（ELISA法）。MDA试剂盒、SOD试剂盒（由南京建成生物工程研究所生产），TNF-α ELISA试剂盒（由上海晶美生物工程有限公司生产）。

    1.4.2　肺组织病理切片　将未灌洗的动物麻醉处死, 打开胸腔,取左肺迅速浸泡于10％ 中性福尔马林液中, 石蜡包埋、切片, HE 染色, 光镜观察。

    1.4.3　肺组织核因子－κB（nuclear factor-κB，NF-κB）检测采用S-P法，兔抗大鼠NF-κB (p65)抗体（由武汉博士德生物工程有限公司生产）、SP超敏试剂盒（由福州迈新生物技术开发有限公司生产）。细胞核和(或) 胞浆呈棕色即阳性细胞。400倍物镜下每张切片随机选5个视野,用图像分析系统（由德国LEICA公司生产，型号Q550CW）分析相对灰度，相对灰度越小,染色强度越大。

    1.5　统计学方法　采用SPSS 12.0统计学软件包进行处理与分析。计量资料采用均数±标准差（■）表示,组间比较行方差分析及t检验。设P＜0.05为差异有统计学意义。

    2　结果

    2.1　BALF中MDA、总SOD、TNF-a及肺组织NF-κB染色强度变化见表1

     由表1可见，高氧暴露3d，BALF中MDA、总SOD、TNF-a及肺组织NF-κB染色强，高氧组与对照组比较，差异均有统计学意义(t分别＝7.07、4.56、6.45、50.08，P均 ＜0.05)； 7d时上述指标高氧组与对照组比较，差异均有统计学意义(t分别＝9.70、7.15、7.20、98.05，P均 ＜0.05)。

    2.2　病理表现见封二图4～6　高氧组3d时见小血管扩张、充血和肺泡内少量出血及炎性细胞浸润; 7d时高氧组毛细血管扩张，充血，组织水肿，炎性细胞浸润加重，肺泡间隔轻度增宽,肺组织结构紊乱。

    3　讨论

     临床中，吸入高浓度的氧气是一种常见和必要的措施。但是长时间高浓度氧气吸入对多个器官和系统均具有毒性作用[1]，对于早产新生儿或本身存在疾病的新生儿尤为突出。早在1967年Northway就首次提出新生儿支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）的概念，并推测其发生与长时间吸入高浓度氧有密切关系。但是，高氧肺损伤的确切机理至今仍未阐明。

     新生SD大鼠在组织发育、病理生理、免疫反应等方面与新生儿有很强相似性，利用新生SD大鼠建立高氧肺损伤模型并在此基础上的实验研究具有性、可行性。SD大鼠生后肺发育分为三期，即膨胀期(生后1～4 d)、肺泡化期(4～13 d)和平衡生长期(14～21 d)。新生儿阶段肺发育处于肺泡阶段[2]，相当于SD大鼠肺泡化期。本次研究对象为生后3～10d的新生SD大鼠，保持了实验模型与临床病理生理较高相似度。氧浓度维持在90％～95％，选择该浓度的原因在于可以较短时间造成急性肺损伤。本次研究对以往的间断监测作了改进，作连续监测,避免氧浓度不稳定对实验结果产生不利影响。氧浓度在每日开舱更换饲料、垫料和母鼠的过程中舱内的氧浓度会迅速下降，这是模型建立的一个不利因素，但是在本次研究中每日开舱时间控制在1h之内，使新生SD大鼠绝大多数时间处在高氧环境中；考虑到高浓度的氧也会对母鼠造成损伤，造成其护理能力的下降，在本次研究中每日将氧舱中的母鼠与空气中的母鼠进行交换，这样既避免母鼠护理能力的下降，又使各组的条件尽量齐同。检测指标和病检查清晰显示高氧组新生SD大鼠呈现急性肺损伤，本次研究成功建立新生儿高氧急性肺损伤的动物模型。

     MDA是脂质过氧化产物，而SOD是机体重要的抗氧化酶系，同时检测这两项指标可以一定程度反映机体氧化/抗氧化平衡。本次研究中高氧组BALF中MDA含量高于对照组,总SOD活性低于对照组（P均<0.05），提示高氧引起脂质过氧化损伤和机体抗氧化酶活性降低，氧化/抗氧化失衡。目前许多研究表明，炎症反应也是高氧肺损伤的重要机理之一[3]。TNF-α是一重要促炎因子，NF-κB是炎症反应中重要的转录因子。TNF-α通过一系列复杂的信号转导路径激活NF－κB[4]，激活了的NF－κB又可进一步促进TNF-a表达上调，形成正反馈，加重肺损伤。本次研究中高氧组TNF-α增加，免疫组化提示NF-κB活化，进一步验证炎症反应在高氧肺损伤中的发挥重要作用。与对照组相比，高氧组BALF中MDA、SOD、TNF-α的变化，结合免疫组化NF-κB检测以及病理学检查结果，清晰地表明： 高氧暴露仅3d即诱发新生SD大鼠急性肺损伤；随时间延长，7d时肺损伤加重：毛细血管扩张，充血，组织水肿，间质内浸润的中性粒细胞、巨噬细胞等增多，肺泡间隔轻度增宽，肺组织结构紊乱，与国内外的有关报道一致[5~7]。新生SD大鼠高氧急性肺损伤早期病理生理改变主要为弥漫性炎症表现，纤维化的慢性改变尚不明显，与新生儿高氧急性肺损伤病变相似。早期的过度炎症反应是后续纤维化改变的基础，提示早期干预新生儿高氧性急性肺损伤对于挽救患儿生命并预防慢性肺疾病具有积极意义[8]。

     本研究研究成功建立新生SD大鼠高氧肺损伤模型，制作方法简便,可重复性高,能定量研究；本次研究提示高浓度氧致脂质过氧化，抗氧化酶系统活性降低，NF－κB过度活化，TNF-α过度释放，氧化/抗氧化系统失衡和过度炎症反应是肺损伤的重要发病机理。

【文献】
  １ Cynthia M, Henry R, Elsie M. The impact of hyperoxia on the neonatal and adult developing dendritic cell[J]. Pediatr Res, 2007, 62(1):78-82.

2 金汉珍, 黄德珉, 官希吉. 实用新生儿学[M]. 第3版. 北京：人民卫生出版社, 2004. 388－390.

3 Chetty A, Cao GJ, Manzo N, et al. The role of IL-6 and IL-11 in hyperoxic injury in developing lung[J]. Pediatr Pulmo- nol, 2008, 43(3):297-304.

4 Wong HR, Odoms KK, Denenberg AG, et al. Hyperoxia prolongs tumor necrosis factor-αmediated activation of NF-κB: role of IκB kinase[J]. Shock, 2002, 17(4): 274-279.

5 池永学, 金正勇, 金政. 牛磺酸对高氧肺损伤的影响[J]. 中 国妇幼保健,2007,22(17):2347-2349.

6 Kunig AM, Balasubramaniam V, Markham NE, et al. Recom- binant human VEGF treatment enhances alveolarization afterhyperoxic lung injury in neonatal rats[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2005, 289(4):L529-535.

7 Suzy AA, Comhair, Serpil CE. Antioxidant responses to oxidant-mediated lung diseases[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2002, 283（2）: L246-L255.

8 廖玲洁, 宁琴, 李玉祥, 等. SB265610抗炎症干预在新生大 鼠高氧肺损伤中的抗氧化作用[J]. 实用儿科临床杂志, 2007, 22(12)：919-92.