气管插管快速灌注博莱霉素复制大鼠肺间质纤维化模型
作者：张伟, 鲁香凤, 张晓梅, 吴建军, 姜良铎
【摘要】 研究大鼠肺间质纤维化的造模方法。 方法：模型组大鼠气管插管灌注不同剂量（7、6、5、3.4、2、1 mg/kg体质量）的博莱霉素A5-生理盐水，对照组给予等体积生理盐水，观察大鼠生存情况、肺组织病理，并深入研究博莱霉素1 mg/kg体质量组，观察大鼠体质量变化，肺组织病理，检测第14天、28天、45天时大鼠肺系数以及血清中转化生长因子β1（transforming growth factor β1, TGF-β1）和血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）的含量。结果：经多个剂量的研究发现，较大剂量博莱霉素气管插管快速灌注法复制大鼠肺间质纤维化模型死亡率高，1 mg/kg体质量气管内灌注博莱霉素A5-生理盐水可以造成大鼠肺组织纤维化改变。深入研究发现，与假手术组比较，1 mg/kg体质量组大鼠肺组织病理14 d已出现明显的纤维化改变，28 d已形成弥漫性纤维化，45 d时纤维化程度进一步加重。与假手术组比较，模型组3、7、14 d体质量降低（P<0.01），21 d体质量虽有所下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）；14、28、45 d时肺系数升高（P<0.01），血清TGF-β1水平从28 d时开始升高（P<0.05，P<0.01），血清PDGF水平45 d时升高（P<0.05）。1 mg/kg体质量组造模死亡率较低。结论：博莱霉素1 mg/kg体质量气管插管快速灌注法可以成功复制大鼠肺间质纤维化模型。
【关键词】 肺纤维化; 模型, 动物; 博莱霉素; 大鼠
Method: Different doses (7, 6, 5, 3.4, 2, 1 mg/kg) of bleomycin A5-saline were infused into the rats’ lung in bleomycin-treated group through tracheal intubation, and rats in sham-operated group were infused with same volume of saline. The living state and lung pathology of the rats were observed. The author deeply studied the condition of the rats in 1 mg/kg bleomycin-treated group, and the changes of body weight and lung pathology were observed. Lung quotient, the content of transforming growth factor β1（TGF-β1）and platelet-derived growth factor (PDGF) in serum were measured on the 14th, 28th and 45th day of the experiment.
Results: The study demonstrated that infusing large doses of bleomycin A5 quickly through tracheal intubation had a high mortality, and infusing 1 mg/kg quickly could successfully develop an animal model of pulmonary fibrosis. Compared with the sham-operated group, fibrosis was appeared obviously in the rats’ lung in 1 mg/kg bleomycin A5-treated group after 14 days of experiment, diffuse fibrosis was appeared after 28 days of experiment, and the fibrosis became more severe after 45 days of experiment. The body weight of the rats in bleomycin-treated group was declined after 3, 7 and 14 days of experiment as compared with the sham-operated group (P<0.01). Twenty-one days after the experiment, the body weight was declined too, but there was no significant difference between the bleomycin-treated group and the sham-operated group (P>0.05). Lung quotient was increased 14, 28 and 45 days after the experiment (P<0.01), the level of serum TGF-β1 began to increase since 28 days after the experiment (P<0.05, P<0.01), and the level of serum PDGF also increased gradually 45 days after the experiment (P<0.05). And the mortality rate of 1 mg/kg bleomycin A5-treated group was lower than those of the other doses of bleomycin A5-treated groups.
Conclusion: A rat model of pulmonary fibrosis can be duplicated successfully by infusing 1 mg/kg bleomycin A5 quickly through tracheal intubation.
Keywords: pulmonary fibrosis; model, animal; bleomycin; rats
肺间质纤维化是一种难治性肺系疾病，研究肺间质纤维化的经典模型为博莱霉素（bleomycin, BLM）诱导的大鼠或小鼠肺间质纤维化模型，该模型的病理变化基本符合肺间质纤维化的病理改变，因此被广泛采用。造模方法多以气管插管或气管切开后灌注BLM，使药物直接进入两肺为主。本课题组经过多个剂量（7、6、5、3.4、2、1 mg/kg）的实验，再结合大鼠肺组织病理变化和死亡率，发现通过BLM 1 mg/kg体质量气管插管快速灌注法可以成功复制大鼠肺间质纤维化模型，且死亡率低。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 清洁级健康雄性Wistar大鼠，体质量180～200 g。由北京维通利华公司提供。许可证号：京动许字（1999）第039号。
1.1.2 主要药品 BLM（15 mg/支，日本化药株式会社，批号为740140）；平阳星（8 mg/支，天津太和制药有限公司，批号为050402）。
1.1.3 主要器材 18号套管针、光源、纱布、35度倾斜鼠板、LEICA RM2135石蜡切片机（德国）、LEICA DMLB显微镜（德国）、OLYMPUS全自动显微摄像系统（日本）、K-70全自动高速冷冻离心机（湘仪-TOMY）、SPECOTRAT酶标比色仪（SLT公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 溶液配制 BLM，用注射用生理盐水配成浓度为4 mg/ml（0.4％）的溶液。平阳星，用注射用生理盐水配成浓度为5 mg/ml（0.5％）、4 mg/ml（0.4％）、2 mg/ml（0.2％）的溶液。
1.2.2 造模方法 大鼠腹腔注射10％水合氯醛3.5 ml/kg体质量麻醉后仰面固定于35度倾斜鼠板上，将光源直接照射于大鼠咽喉部皮肤表面，左手垫纱布向外向上提起舌头，可见咽喉部有一明显的亮点。从大鼠口腔，右手水平插入18号套管针到达咽喉部时，压低针尾，使针头抬高15～30度角，轻轻插入气管，长度约套管针长度的3/4，拔出针芯。将棉球薄片置于套管针外口，若棉球薄片随呼吸前后摆动，则说明套管针已经插入气管，若棉球薄片不随呼吸前后摆动，可能套管针误入食道，应立即拔出重新插入。向气管插管内快速注射BLM溶液，假手术组注射等体积生理盐水，并继续向气管内快速推注0.3～0.5 ml空气，立即将大鼠直立旋转，以使药液在双肺内分布均匀。动物清醒后随意进食。
1.2.3 造模情况 第1次：BLM用注射用生理盐水配成浓度为4 mg/ml（0.4％）溶液，造模剂量为1.5 ml/kg体质量，即6 mg/kg体质量。共130只大鼠。第2次：平阳星用注射用生理盐水配成浓度为5 mg/ml（0.5％）溶液，原拟分为7、6、5 mg/kg体质量等3个剂量组，即1.4、1.2、1.0 ml/kg体质量，但由于实际操作中药物损失，最后1只药量不足，反推药量为3.4 mg/kg体质量，形成7、6、5、3.4 mg/kg体质量等4组，各组大鼠数量分别为2、2、4、1只。第3次：分为2个剂量组，2 mg/kg体质量剂量组，平阳星浓度为4 mg/ml（0.4％），用量为0.5 ml/kg体质量；1 mg/kg体质量剂量组，平阳星浓度为2 mg/ml（0.2％），用量为0.5 ml/kg体质量。每组各2只。第4次：深入研究1 mg/kg体质量模型，平阳星浓度为2 mg/ml（0.2％），用量为0.5 ml/kg体质量，共44只。分为24 h、72 h、7 d、14 d、28 d、45 d共6个时间点，前3个时间点各5只，后3个时间点共29只，由于有死亡大鼠，14、28、45 d取材数量分别为8、8、9只。
1.2.4 取材方法 10％水合氯醛3.5 ml/kg体质量腹腔注射麻醉。麻醉后将大鼠仰卧固定于解剖台上，常规消毒切开皮肤，分离腹主动脉，用注射器采血，分离血清，置－30 ℃冰箱冻存，备用。打开胸腔取出肺脏，完整分离出气管和双肺，仔细去除周围结缔组织，经生理盐水洗涤后用滤纸吸干，天平称量肺湿质量，计算肺系数。右肺冻存制备组织匀浆液，左肺经大体观察后用10%福尔马林液固定。
1.2.5 血清转化生长因子β1和血小板衍生生长因子检测 采用酶联免疫法测定血清中转化生长因子β1（transforming growth factor β1, TGF-β1）、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）的含量。试剂盒由尚柏生物医学技术（北京）有限公司提供。
1.2.6 肺组织病理检查 左肺经10%福尔马林固定后取材，常规石蜡包埋，连续切片2张，分别做HE染色和Masson染色（改良法），光镜下观察。
1.3 统计学方法 采用SPSS 11.0软件包进行统计学处理，实验数据用x±s表示，两组间比较用t检验，检验水准为0.05。
2 结 果
2.1 前期工作结果 第1次实验，24 h内没有明显的异常反应，24 h后大鼠开始出现浑身颤抖，蜷缩成团，呼吸急促，口、鼻、眼睛出血，便血，爪甲紫绀，舌质紫暗等症状，部分大鼠急躁、挣脱鼠笼。24～48 h内死亡14只，48～72 h内死亡79只。解剖部分大鼠，并做肺组织病理，发现两肺弥漫性充血肿胀，病理结果显示肺组织呈急性炎症反应，有透明膜形成。3～10 d内仍有大鼠陆续死亡，最后仅存活4只大鼠，生长状态良好，于44 d取材做肺组织病理，显示肺部有纤维化改变，但病变较轻。
第2次实验，24 h内没有明显异常反应，24 h后开始有明显的蜷缩、嗜卧和出血；第3天，7 mg/kg体质量组的2只大鼠全部死亡，6 mg/kg与5 mg/kg组各死亡1只；第4天，6 mg/kg与5 mg/kg组各死亡1只；第5天，5 mg/kg组死亡1只。对所有死亡大鼠进行解剖，均表现为全肺的肿胀、充血、出血。至第6天，分别对5 mg/kg组和3.4 mg/kg组存活下来的2只大鼠进行解剖时发现，5 mg/kg组大鼠的肺组织没有充血、出血、水肿等任何异常表现，可判定是正常的肺组织，推测造模有误，将其排除于5 mg/kg组之外；3.4 mg/kg组大鼠肺组织也表现为全肺的肿胀、出血、充血，但程度较7、6、5 mg/kg组为轻。至此，以7、6、5 mg/kg造模的大鼠在5 d内全部死亡，3.4 mg/kg组大鼠存活至第6天处死，肺部表现较其他剂量组略轻。
第3次实验，以2、1 mg/kg体质量摸索，24 h内没有明显异常反应，24 h后大鼠均表现为蜷缩、嗜卧、颤抖、毛发耸立，其中1只1 mg/kg组大鼠眼睛出血较重，在第3天，出血状况好转并基本吸收，至第8天时，解剖表现为全肺的肿胀，弥漫的灶状出血和瘀斑，经过解剖1 mg/kg组2只大鼠和2 mg/kg组1只大鼠之后发现2个剂量组没有明显差别。为观察此2种剂量组大鼠是否会死亡，临时决定暂不处死另1只2 mg/kg组大鼠，于造模后28 d常规取材。病理结果显示2、1 mg/kg组，在造模第8天已经形成纤维化病灶。
2.2 BLM 1mg/kg体质量造模结果
2.2.1 整体状态 假手术组大鼠活泼好动，呼吸平稳，饮食如常，强壮肥硕，皮毛光亮润泽，体质量逐渐增加。博莱霉素造模组动物清醒后常规饲养，24 h内观察发现，动物除进食量、饮水量有所减少以及相对假手术组安静外无明显异常，24～48 h内模型组进食量和饮水量较造模第1天均明显下降，精神不振，聚集成团，呼吸急促，身体抖动，毛发耸立若恶寒颤栗状，同时发现部分大鼠眼、鼻出血，大鼠趾甲可见血痂，舌质紫暗；48～72 h内发现模型组有1只大鼠眼鼻出血严重并伴腹泻，其余先前有眼鼻出血的大鼠均已减轻并基本吸收；72～96 h内模型组有2只大鼠死亡。动物进食饮水量在造模72 h后开始逐渐增加，但仍相对假手术组为少。模型组在造模后第10天和第20天各死亡1只。BLM造模大鼠的整体状态明显不如假手术组，基本状态在造模前7 d最重，此后逐渐恢复，体质量也逐渐增长。
2.2.2 体质量 根据大鼠体质量进行随机分组，经统计学检验，造模前各组大鼠体质量差异无统计学意义。假手术组大鼠体质量平稳上升。造模后第3、7、14天，模型组与假手术组比较体质量均显著下降（P<0.01）；第21天模型组体质量与假手术组比较，差异无统计学意义。此后模型组与假手术组比较差异亦无统计学意义。见表1。
2.2.3 肺系数 造模第14天、28天和45天，模型组大鼠肺系数均显著高于假手术组（P<0.01）。见表2。表1 大鼠体质量（略）表2 大鼠肺系数（略）
2.2.4 血清TGF-β1含量 第28天，模型组TGF-β1水平高于假手术组（P<0.05）；第45天，模型组TGF-β1水平继续升高，与假手术组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。见表3。
2.2.5 血清PDGF含量 第14、28天模型组PDGF高于假手术组，但差异无统计学意义；第45天时模型组PDGF继续升高，显著高于假手术组（P<0.05）。见表4。表3 大鼠血清TGF-β1含量（略）
2.2.6 大鼠肺组织病理变化
2.2.6.1 大体标本肉眼观察 假手术组双肺未见明显病变，表面光滑，粉白色，质地均匀，弹性良好，切面均匀，无实变表现，无囊腔。模型组于造模第14天双肺体积较正常饱满，肺表面凹凸不平，部分动物肺组织可见大小不等的囊气腔突出，肺组织弹性减弱，局部可见散在出血点，部分区域呈苍白色，切面呈实性变，轻重不一，还可见多个针尖及米粒大小囊腔；造模第28天双肺体积较第14天有所减小，仍较正常饱满，肺表面凹凸不平，部分动物可见多个大小不等的囊气腔突出，脏层胸膜局灶性瘢痕形成，散在少量出血点及黄白色灶，切面呈弥漫性实变，并可见多个大小不等的囊腔，肺组织质地明显变硬；造模第45天肺表面凹凸不平，脏层胸膜可见局灶性瘢痕形成，散在陈旧出血点，表面淡黄淡褐灰白相间，仍可见突出的囊腔，但囊腔变小，数量较第14天和第28天减少，切面可见实变区及囊腔，实变区质硬，但面积较第28天减小。
2.2.6.2 光镜下肺组织病变化 假手术组大鼠肺组织结构清晰，肺被膜未见纤维素渗出及炎细胞浸润，肺泡壁完整、无增宽，无肺萎陷及血管壁增厚，支气管腔及肺泡腔内未见炎性渗出物，少数大鼠各级支气管壁及肺泡间隔可见少量炎细胞浸润。模型组24 h肺组织局部有水肿表现；72 h肺组织呈弥漫性炎症反应；7 d已经有成纤维细胞灶形成，三色染色亦可见肺组织胶原纤维沉积，纤维化形成。模型组造模第14天时肺组织可见实变，实变区呈斑片状分布，支气管周围病变尤为明显，且伴有轻度肺水肿和血管周围水肿。肺组织局部可见出血，胸膜下病变牵拉导致胸膜凹陷，肺泡间隔增宽充血，可见炎细胞浸润，以淋巴细胞、单核细胞和组织细胞浸润为主，散在少量的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及浆细胞。局部Ⅱ型肺泡上皮和细支气管上皮细胞增生，部分肺泡内可见巨噬细胞簇集成团、纤维母细胞及纤维细胞增生，纤维化区可见数量不等的胶原纤维沉积，炎症细胞相对较少，可见大小不等的囊性纤维气腔形成，即“蜂窝肺”。部分囊性纤维气腔表面被覆少量支气管上皮细胞，在纤维化区和蜂窝肺区可见呼吸性细支气管、肺泡管。重建的囊壁内有增生的平滑肌束，即肌硬化现象，残存的肺泡区可见代偿性肺气肿，可见肺大泡形成。造模第14天已具备成纤维细胞灶，伴胶原沉积的瘢痕化、蜂窝等诊断普通型间质性肺炎或特发性肺间质纤维化的病变［1，2］。造模第28天，上述病变进一步加重，纤维化区增多，面积扩大，可见大量增生的纤维细胞和胶原纤维沉积，纤维囊性气腔及炎细胞尤其是嗜酸性粒细胞较第14天明显增多。造模第45天，蜂窝肺减轻，纤维化有所加重，局部可见较多嗜酸性粒细胞浸润，肺泡腔内有大量巨噬细胞浸润，局部可见陈旧性出血灶。三色染色中胶原纤维染成绿色，纤维化程度的变化与HE染色病理一致。见图1～16。
3 讨 论
BLM是一种临床上常用的抗肿瘤药物，给药后广泛分布到各组织。其主要的副作用是肺毒性，引起肺泡炎并很快进展为肺间质纤维化。1974年，Ademson等［3］首先采用腹腔多次注射BLM的方法，建立了鼠肺间质纤维化动物模型。1982年，Thrall等［4］证实给大鼠气管内一次性灌注BLM可形成类似于人类弥漫性肺间质纤维化的病变。目前BLM诱导的鼠肺间质纤维化模型已成为当今国际上研究肺间质纤维化普遍采用的实验方法，其病理特点表现为早期的肺损伤过程和其后的纤维化。
本实验在前期工作的基础上对BLM 1 mg/kg体质量组进行深入探讨，结果显示造模后大鼠体质量普遍下降，第3天时体质量降至最低点，第7天时基本恢复至术前水平，此后大鼠体质量逐渐增长，但始终低于假手术组，差异有统计学意义，而在造模21 d以后与假手术组比较，差异无统计学意义。14、28、45 d等3个时间点，大鼠肺系数均显著高于假手术组，14 d时肺系数最大，随着时间的延长，肺系数逐渐减小。肺组织病理显示在14 d时已经形成纤维化，28 d纤维化程度明显加重，形成全肺的弥漫性病变，45 d与28 d比较，蜂窝肺减轻，而纤维化有所加重。在肺间质纤维化的发生机制中，TGF-β1和PDGF是与纤维化形成密切相关的细胞因子［5-8］，在多个环节与其他因素一起起到促纤维化形成的作用，且二者相互作用，如PDGF可以促进TGF-β表达，增殖期TGF-β1也可通过诱导PDGF的分泌而促进增生。血清学检测14、28、45 d等3个时间点模型组TGF-β1水平持续升高，与假手术组比较都显著升高，而PDGF水平也呈持续升高趋势，在45 d时显著高于假手术组，其水平的升高与报道一致。可见BLM 1 mg/kg体质量气管插管快速灌注法可以成功复制大鼠肺间质纤维化模型，且死亡率低。
我们发现，大剂量BLM气管灌注会导致死亡率增加，且肺组织病理变化有别于普通型间质性肺炎的病理变化，如第1次实验肺组织病理表现有透明膜形成。第1次试验后造模药物更换为平阳星，由于对2种药物中BLM的效价不确定，因此剂量反而加大，但是大鼠均以死亡告终，唯一存活的是3.4 mg/kg体质量的小剂量组大鼠，但其肺组织大体观察与文献报道的“灶状”病变不一致，因此再次减量研究。由于1 mg/kg体质量剂量时病理发现已经达到病变程度，并且已经形成成纤维细胞灶，具备形成纤维化的基础，因此确定以1 mg/kg进行造模。我们认为复制该动物模型的要点是：第一，BLM剂量为1 mg/kg体质量，并严格按照体质量控制给药剂量；第二，做到插管准确、快速灌注，并迅速推注空气，直立旋转，其目的在于使药液完全进入并均匀地分布于两侧肺组织，如果慢推，则将随大鼠呼吸运动而使药液溢出导致实际进入药量减少，同时可能导致大鼠呼吸困难，增加大鼠的死亡率。
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