调心方中β淀粉样蛋白结合成分的初步探讨

                       作者：程敏, 冯琼, 钱淑文, 高慧, 朱粹青

【关键词】  β淀粉样蛋白; 调心方; 乳酸脱氢酶; 老年性痴呆

     Objective: To explore whether there are β-amyloid protein (Aβ) binding elements in heart-beneficial recipe (HBR, a compound traditional Chinese herbal medicine), which can ameliorate the cytotoxicity of Aβ.

    Methods: The extract of HBR and Aβ1-40 were co-precipitated, and the Aβ1-40 in pellets was detected by immunoblotting. Affi-gel-Aβ1-40 was constructed, and Affi-gel-Aβ1-40 affinity elements from the extract of HBR were analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC). The assay of lactic dehydrogenase (LDH) release from the primary cultured rat cortex neurons was used to evaluate the cytotoxicity of Aβ1-42, and the protection effects of the HBR serum and the Affi-gel-Aβ1-40 treated HBR serum.

    Results: Immunoblotting examination showed Aβ1-40 could be co-precipitated with components of HBR following co-incubation, and the amount of Aβ1-40 within pellets decreased when the HBR extract was diluted. Aβ1-40 affinity elements from the extract of HBR, eluted from Affi-gel-Aβ1-40 by glycine solution (pH=2.5), could be detected by HPLC-fluorescent detector system. The analysis of LDH release showed that exposure of neurons to 5 μmol/L Aβ1-42 for 48 h caused a significant increase of LDH release in either a serum free or 10% serum contained culture condition (P<0.01). The rat HBR serum was able to suppress Aβ1-42 induced LDH release (P<0.05), whereas Affi-gel-Aβ1-40 treated HBR serum still maintained the ability to attenuate Aβ1-42 induced LDH release although the effect was somewhat decreased compared with Affi-gel treated HBR serum.

    Conclusion: There are Aβ affinity components in HBR, which could not increase the Aβ cytotoxicity, but might be able to inhibit the cytotoxicity of Aβ. The results implied that the exploration of Aβ affinity elements from Chinese medicinal recipe which is effective for Alzheimer disease, might be an important direction in Alzheimer disease therapeutic research area.

    Keywords: β-amyloid protein; heart-beneficial recipe; lactic dehydrogenase; Alzheimer disease

    老年性痴呆（A1zheimer disease, AD）是一种与增龄相关的神经系统退行性疾病。随着社会人口的老龄化，其发病率呈上升趋势。β淀粉样蛋白（β-amyloid protein, Aβ）不仅是AD脑病理结构之一，即老年斑的主要组分，而且Aβ所介导的神经毒性在AD脑病理改变中起非常重要的作用，它可激活胶质细胞分泌多种细胞因子，诱导与神经纤维缠结相关的tau蛋白磷酸化，诱导神经元凋亡等［1］。因此，目前抗Aβ的神经毒性作用已成为防治AD研究的重要方向之一［2］。调心方的临床研究提示其有改善AD痴呆症状的作用［3，4］，而实验研究已经显示其可减少Aβ诱导的神经毒性［5-7］。本实验试图探索调心方中是否有直接与Aβ作用并抑制Aβ神经毒性的成分。

    1  材料与方法

    1.1  调心方提取物Aβ结合分析

    1.1.1  调心方提取物与Aβ共沉淀并对沉淀物中的Aβ进行免疫印迹检测  调心方提取液，由党参、桂枝、茯苓、远志、石菖蒲等组成，用水提醇沉法制成相当于含生药7.4 g/ml的水溶液，成年人用量相当于生药2.48 g/kg体质量，由上海市中医老年医学研究所提供。不同浓度稀释的调心方1 ml加Aβ1-40 50 μg（吉尔生化上海有限公司）混匀后，于室温条件下在旋转混合仪（10 r/min）上作用2 h；12 000 r/min离心10 min。取沉淀加同量十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）加样缓冲液重悬沉淀，100 ℃处理5 min，Tris/Tricine 15%聚丙烯酰胺凝胶电泳［8］，电转移至聚氟乙二烯（PVDF）膜上，用4G8抗体（Sigma公司产品）免疫印迹检测沉淀中的Aβ含量。

    1.1.2  制备Affi-gel-Aβ1-40  Affi-gel 10 Gel (Bio-Rad)为含活性基团N-羟基琥珀酰亚胺酯的琼脂糖珠子。说明书，取Affi-gel 10 Gel 200 μl与1 mg Aβ1-40在4 ℃ 0.1 mol/L 3-（N-吗啉代）丙磺酸（pH 7.5）和0.3 mol/L CaCl2液中反应4 h。用二乙胺封闭多余的活性基团，PBS缓冲液充分洗涤，去除未结合的Aβ1-40。用二乙胺封闭的Affi-gel 10 Gel作为对照。200 μl Affi-gel-Aβ1-40分别加1 ml调心方提取液原液和9 ml PBS（pH 7.2），室温下于旋转混合仪（10 r/min）上作用2 h。PBS缓冲液充分洗涤，100 mmol/L甘氨酸（pH 2.5）洗脱结合成分。

    1.1.3  高效液相色谱检测  取20 μl洗脱液加10 μl衍生液［27 mg邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde, OPA）和40 μl 2-巯基乙醇溶于5 ml甲醇，加0.1 mmol/L四硼酸钠缓冲液，pH 9.6］，轻轻混匀后静置2 min进行柱前衍生，进样20 μl。高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）分析流动相A为磷酸钾缓冲液（pH 6.0），流动相B为含35%甲醇和2%四氢呋喃的磷酸钾缓冲液，由System Gold软件进行洗脱梯度控制。色谱柱为Ultrasphere 4.6 mm×25 cm ODS分析柱（5 μm颗粒）。由157荧光检测仪检测（激发波长280 nm，发射波长340 nm）。

    1.2  调心方抑制Aβ对原代培养神经元的毒性作用

    1.2.1  Aβ1-42的制备  Aβ1-42（Sigma公司产品）在临用前先溶于含0.1%氨水的双蒸水，再用培养液稀释到所需浓度。

    1.2.2  调心方含药血清的制备  雄性Wistar成年大鼠，以成人等效剂量的2倍灌胃，每天2次，连续3 d，末次给药后1 h采血，分离血清［7］。100 μl血清经Affi-gel-Aβ或Affi-gel 50 μl吸附处理1 h后，以10%的终浓度用于培养细胞。

    1.2.3  大鼠原代神经元培养以及乳酸脱氢酶检测  神经元培养用16 d的胎鼠（复旦大学动物中心提供），取皮层在含0.2%胰蛋白酶的PBS中消化，吹散。细胞以5.0×105个/cm2培养于多聚赖氨酸包被的培养皿中，培养液为Neurobasal/B27加谷氨酰胺、青霉素和链霉素等。原代神经元培养7 d后用于实验。乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase, LDH）漏出分析用细胞内LDH漏出至培养液中的量来反映细胞损害的程度。培养液中LDH的检测根据试剂盒（南京建成生物工程研究所）的说明书进行。以处理与未处理的原代培养神经元培养液检测值的百分比来反映细胞毒性。

    1.3  统计学方法  数据用Excel 2000的Student’s t检验进行各组间分析。P<0.05认为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  调心方共沉淀Aβ1-40  调心方提取液中加入Aβ，相互作用后，在离心沉淀中可检出Aβ。随调心方的稀释，沉淀减少；同样，随调心方的稀释，可见沉淀的Aβ量也减少。另外还可见调心方沉淀中Aβ的电泳迁移并没有明显的改变。见图1。

    2.2  HPLC检测Affi-gel-Aβ1-40吸附的调心方成分  被Affi-gel-Aβ1-40吸附的调心方成分，如果不经OPA柱前衍生处理，本实验的HPLC分离检测系统则无法检测到阳性信号，见图2A；而经柱前衍生可检测到一些阳性信号，第1、3峰为特异峰，见图2B和D；图2C和E中的2号峰为洗脱液中的甘氨酸峰，而4号峰由于在对照Affi-gel吸附成分中也能被检测到，因此认为是非特异峰。

    2.3  Affi-gel-Aβ1-40吸附处理的调心方药物血清对Aβ1-42诱导的神经元损害的影响  实验观察了较低浓度的Aβ1-42对原代培养神经元的损伤作用。结果显示，1 μmol/L和5 μmol/L Aβ1-42在无血清环境中处理48 h后均可导致明显神经元损害，LDH漏出率分别为［（124.9±21.3）%，n=6］和［（148.7±19.7）%，n=6］，较溶剂假损伤对照［（100.0±10.7）%，n=6］显著增加（分别为P＜0.05和P＜0.01）。同样在含10%正常大鼠血清的系统中，5 μmol/L Aβ1-42处理48 h后LDH漏出率［（134.4±13.9）%，n=6］也较溶剂假损伤对照［（100.0±9.1）%，n=6］明显增加（P<0.01）；而10%调心方大鼠血清可显著减少Aβ1-42诱导的LDH漏出率［（110.6±14.2）%，n=6），差异有统计学意义（P<0.05）。经Affi-gel-Aβ吸附处理的调心方药物血清能显著减少Aβ1-42诱导的LDH漏出率［（118.2±10.4）%，n=6；P<0.05］；用作为对照的Affi-gel吸附处理的调心方药物血清亦能显著减少Aβ1-42诱导的LDH漏出率［（107.9±11.8）%，n=6；P<0.01）。经Affi-gel-Aβ吸附处理的药物血清的效果较Affi-gel吸附处理药物血清效果有所下降，但两者之间的差异无统计学意义。见图3。

    3  讨  论

    目前对AD的是研究热点之一，研究发现许多中药制剂可改善AD的学习记忆能力，如调心方和脑还丹等［3，4，9］。调心方以党参补心气、安神明；以远志、石菖蒲、茯苓化痰浊、通心窍，用之于临床，的确能有效改善AD患者认知功能和生活能力［3，4］。以往的实验研究主要集中在明确调心方抗Aβ对神经系统损害的效果以及调心方调节神经元凋亡相关基因表达［5，7］。但调心方中的某药物成分是否有可能通过直接与Aβ作用而抑制Aβ毒性，目前尚未见报道。

    本实验用的是新鲜配置的Aβ，一般认为是单体型。实验显示，随提取液的稀释，Aβ与调心方共沉淀也明显减少；提示Aβ单体沉淀与调心方提取液中的成分有关，而不是Aβ的非特异沉降。沉淀中的Aβ电泳迁移没有明显变慢，提示与Aβ结合的成分在变性条件下可游离下来。为进一步验证调心方中有Aβ结合成分，利用HPLC分析系统对此进行了分析，结果同样提示调心方中有与Aβ结合的物质存在，但尚不知道这些是什么物质。根据本实验室HPLC分析系统检测的是小分子物质的原理，提示调心方中存在与Aβ结合的小分子物质；由于实验条件限制，不能排除调心方中有未能检测到的能与Aβ结合的大分子存在。另外，由于这种方法需要样品的柱前衍生，其原理是基于OPA与巯基试剂在碱性条件下与伯胺类反应产生异吲哚衍生物，因此我们推测本实验HPLC检测观察到的Aβ结合组分为含伯胺基团的小分子；同样，如果有能与Aβ结合而不含伯胺基团的物质，这种方法也检测不到。

    能与Aβ结合的物质并不一定对抗Aβ神经毒性，有些结合物可能反而促进Aβ的神经毒性，例如ApoE4 ［10］。为了解调心方中与Aβ结合的成分对Aβ神经毒性的影响，我们用小剂量（1 μmol/L和5 μmol/L）单体Aβ1-42对原代培养神经元作用48 h的模型进行了观察，这种模型可能涉及Aβ在培养体系中对细胞本身Aβ代谢的影响以及Aβ在培养体系中的聚集［11］。结果显示调心方药物血清在Affi-gel-Aβ1-40吸附处理后，其抗Aβ1-42毒性作用有下降趋势，但仍有效。提示调心方中的Aβ结合成分可能不会促进Aβ1-42的毒性；同时也反映调心方药物血清中除有Aβ结合成分外，可能还有其他调节神经元抗损伤的成分。以后的研究还需要进一步处理药物血清中干扰观察指标的成分，因为正常血清成分中也含有Aβ结合成分，如甲状腺激素结合蛋白（transthyretin）［12］。

    给予外源性Aβ结合物质来抑制Aβ的神经毒性是目前AD研究中的一个重要领域 ［2, 10］。例如，原本用于老年斑检测的刚果红也被用于抗Aβ神经毒性的研究［2］，而刚果红其实也是从植物中提取的物质。从对AD有效的中药方剂中提取、鉴定Aβ结合物质，研究它们的神经保护作用，将是一个值得关注的研究方向。

【】
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