黄芪注射液对basal?like型乳腺癌细胞MDA?MB?468增殖的影响
【摘要】 目的：观察黄芪对basal?like乳腺癌细胞MDA?MB?468和小鼠骨髓基质干细胞（murine bone marrow stromal stem cells, mMSCs）增殖的影响及其异同。方法：用不同浓度的黄芪注射液（Astragalus injection, AI）分别干预MDA?MB?468和mMSCs，不加AI培养2 d的MDA?MB?468细胞作为空白对照。用相差倒置显微镜观察细胞形态，透射显微镜观察细胞超微结构。运用细胞计数试剂盒（cell counting kit?8, CCK?8）检测AI对MDA?MB?468的细胞毒性作用。流式细胞术检测AI对细胞周期和细胞凋亡的影响。酶比色法监测 MDA?MB?468细胞培养上清乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）含量。免疫细胞化学法检测AI对MDA?MB?468表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）和p53蛋白表达的影响。结果：1 g/ml AI对MDA?MB?468的增殖有明显的抑制作用，且具有时效关系。1 g/ml AI对mMSCs的增殖有明显的抑制作用，但其抑制作用不及顺铂，而0.1 g/ml AI对mMSCs的增殖有明显的促进作用。不同浓度的AI能诱导MDA?MB?468细胞凋亡。不同浓度AI组和顺铂组MDA?MB?468细胞培养上清LDH水平，与空白对照组相比，差异均无统计学意义。AI能显著下调EGFR和p53蛋白的表达。结论：AI对MDA?MB?468和mMSCs增殖的影响与药物浓度有关，其抑制MDA?MB?468增殖和诱导凋亡的机制可能通过下调EGFR和p53蛋白的表达而实现。
【关键词】 黄芪注射液; 乳腺癌; MDA?MB?468细胞; 细胞增殖; 小鼠
Objective: To investigate the effects of Astragalus injection (AI) on basal?like breast cancer cell line MDA?MB?468 and murine bone marrow stromal stem cells (mMSCs).Methods: MDA?MB?468 cells and primary cultured mMSCs were treated by different concentrations of AI, and with untreated MDA?MB?468 cells as blank control. The morphology of cells was observed by phase?contrast inverted microscope and transmission electron microscopy. Cytotoxic effects of AI on MDA?MB?468 cells and mMSCs were evaluated by cell counting kit?8 (CCK?8) assay. Cell cycle and apoptosis of MDA?MB?468 cells induced by AI were measured by flow cytometry. Lactate dehydrogenase (LDH) activity in supernatants was measured by enzymatic colorimetric method. The expressions of epidermal growth factor receptor (EGFR) and p53 protein in MDA?MB?468 cells were evaluated by streptavidin?biotin?peroxidase complex method.
Results: A time?dependent cytotoxic effect of 1 g/ml AI was observed in MDA?MB?468 cells. 1 g/ml AI also had cytotoxic effect on mMSCs, but its effect was not better than cisplatin. 0.1 g/ml AI could promote the proliferation of mMSCs. Different concentrations of AI could all induce the apoptosis of MDA?MB?468 cells. There was no significant difference in LDH activity in the supernatants between blank control group and AI?treated and cisplatin?treated groups. AI could down?regulate the expressions of EGFR and p53 protein.Conclusion: The effects of AI on MDA?MB?468 cells and mMSCs are related to the concentration of AI, and its mechanism of inhibiting the proliferation of MDA?MB?468 cells may be due to down?regulation of the expressions of EGFR and p53 protein.
Keywords: Astragalus injection; breast cancer; MDA?MB?468 cells; cell proliferation; mice
乳腺癌是严重危害妇女健康的恶性肿瘤，在我国的发病率持续上升，尤其北京、上海等大城市女性乳腺癌发病率已列居女性恶性肿瘤发病率首位，并呈现出发病年龄年轻化的趋势［1］。根据雌激素受体（estrogen receptor, ER）、孕激素受体（progestin receptor, PR）和人表皮生长因子受体?2（human epidermal growth factor receptor?2, HER?2）的表达，国际上将乳腺癌划分为luminal A、luminal B、HER?2过表达、basal?like和normal breast?like等亚型［2，3］。其中basal?like型乳腺癌短期内容易发生远处转移，生存期较短，患者年龄偏低，除手术和放化疗外，不适合使用内分泌，也无其他有效的治疗手段［4］，这已成为目前临床治疗的难点和研究的热点。因此，中医药干预在该亚型乳腺癌的综合治疗中就显得尤为重要。本实验通过观察黄芪对basal?like乳腺癌细胞MDA?MB?468的增殖、细胞周期和凋亡以及表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）和p53蛋白表达的影响，探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞株
Basal?like型乳腺癌细胞株MDA?MB?468购自院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。
1.1.2 药物及试剂
黄芪注射液（Astragalus injection, AI）（批号：0611121），10 ml/支，每支相当于含生药20 g，购自正大青春宝药业有限公司；顺铂注射液（批号：S081881），1 mg/ml，购自澳大利亚F. H. Faulding & Co. Ltd. Trading as David Bull；胎牛血清（批号：560553）、L?15培养基（批号：1300873）和McCoy’s 5A培养液（批号：1329702）均购自美国Gibco公司；细胞计数试剂盒（cell counting kit?8, CCK?8）（批号：VX749）购自日本同仁化学研究所；p53抗体（批号：200703）和EGFR抗体（批号：200703）均购自武汉博士德生物工程有限公司；二氨基联苯胺（diaminobenzidine, DAB）底物试剂盒（批号：200608）购自上海长岛生物技术有限公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）检测试剂盒（批号：683?639?01）购自中国罗氏公司；Triton X?100、碘化丙啶（propidium iodide, PI）、RNase酶由上海肿瘤乳腺实验室流式细胞室提供。
1.1.3 实验仪器及设备
CO2培养箱（Heraeus），荧光倒置显微镜（Olympus），超净工作台（苏净集团），Thermo Labsystems Multiskan MK3全自动酶标仪，Facscalibour流式细胞仪（BD Bioscience）、Philips CM?120透射电子显微镜和日立7170s全自动生化分析装置。
1.2 实验方法
1.2.1 CCK?8法检测AI干预MDA?MB?468细胞的量效和时效关系
取对数生长状态良好的MDA?MB?468细胞，制备单细胞悬液，调整细胞浓度为2.5×104/ml，以每孔5×103的量接种于96孔板，待细胞生长基本融合后加入AI，使其终浓度分别达到含生药量1 g/ml、0.1 g/ml和0.01 g/ml。同时另设调零孔和阴性对照孔。每组设5个复孔。于作用2 d后，每孔加培养液100 μl、CCK?8溶液10 μl，37 ℃孵育2 h。应用MK3酶标仪，于波长450 nm处测得每孔的吸光度（absorbance, A），检测量效关系。另以AI终浓度分别为1 g/ml和0.1 g/ml含药培养液作用1、2、3、4、5、6和7 d时测定每孔的A值，隔日更换培养液。检测时效关系。
1.2.2 透射电子显微镜下观察MDA?MB?468细胞超微结构
取对数生长期细胞，将终浓度为1 g/ml和0.1 g/ml的AI作用细胞2 d后，用细胞刮刀刮下细胞后，收集细胞，2 000 r/min离心15 min，弃上清，缓缓加入4 ℃预冷的2%戊二醛固定1 h。1%锇酸后固定，丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，制成50 nm超薄切片，经3%醋酸铀?枸橼酸铅双染色后在透射电子显微镜下进行观察。以不加AI培养2 d的MDA?MB?468细胞作为空白对照。
1.2.3 流式细胞术检测MDA?MB?468的细胞周期和凋亡
取对数生长期细胞，将终浓度为1 g/ml和0.1 g/ml的AI作用细胞2 d后，用0.25%胰酶消化成单细胞悬液，1 000 r/min，离心5 min，弃上清；用95%乙醇固定细胞，加1 ml预冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮。1 500 r/min，离心5 min，弃上清；加曲通（Tritonx?100）1 ml，室温下静止10 min，1 500 r/min，离心5 min，弃上清；加入PBS清洗一次，弃上清，加RNase酶1 ml 37 ℃水浴恒温箱振荡10 min，1 500 r/min，离心5 min，弃上清；加PI 1 ml染色，用孔径60 μm的尼龙网过滤后，存放在4 ℃冰箱内20 min后上机检测。
1.2.4 药物等效性实验
小鼠骨髓基质干细胞（murine bone marrow stromal stem cells, mMSCs）取自昆明种小鼠的股骨骨髓，其原代培养参照董鸿铭［5］等报道。原代培养传代一次后取对数生长期细胞，制备单细胞悬液，调整细胞浓度，以每孔5×103的量接种于96孔板，培养2 d，换成终浓度为1 g/ml和0.1 g/ml的AI，作用2 d后，CCK?8法检测各孔A值。空白对照组加等量培养液，顺铂组加终浓度为30 μg/ml的顺铂注射液。
1.2.5 酶比色法检测MDA?MB?468细胞培养上清中LDH水平
吸取药物干预2 d后的各孔培养上清，150 μl/孔。酶比色法检测各孔培养上清中的LDH水平。
1.2.6 免疫细胞化学法检测MDA?MB?468细胞的EGFR和p53蛋白的表达
将无菌盖玻片置于6孔板内，每孔内加入浓度为5×104/ml的单细胞悬液2 ml，培养2 d，换成终浓度为1 g/ml的AI，作用2 d后，弃上清，4%多聚甲醛固定30 min，蒸馏水清洗。30% H2O2?甲醇（1∶50）溶液浸泡30 min，蒸馏水洗3遍。滴加5%牛血清白蛋白，20 min，甩去多余液体，不洗。滴加一抗，阴性对照组滴加等量PBS溶液，4 ℃过夜。PBS溶液清洗2 min×3次，滴加2抗，室温20 min，PBS溶液清洗2 min×3次。滴加链霉亲和素?生物素?过氧化物酶复合物，室温20 min，PBS溶液清洗5 min×4次。DAB显色，室温显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤。苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，镜下观察，拍照记录。结果分析：采用Image?Pro Plus 6.0图像分析软件进行分析，测定阳性细胞的面积总和以及总体光密度的总和，比较浓度为1 g/ml的AI和空白对照组之间EGFR和p53蛋白平均光密度（平均光密度=总体光密度总和/阳性细胞面积总和）的差异。
1.3 统计学方法
所有实验数据均采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料均数用x±s表示，采用单因素方差分析，方差齐时用LSD法比较组间差异，方差不齐时用Dunnett T3法比较组间差异；两样本均数比较采用成组t检验。
2 结 果
2.1 AI干预MDA?MB?468细胞的量效和时效曲线 CCK?8检测结果显示，不同浓度的AI干预MDA?MB?468细胞2 d后，其对MDA?MB?468细胞增殖的抑制作用随药物浓度的减小而减弱，浓度为1 g/ml时，AI对MDA?MB?468细胞的增殖有明显的抑制作用，而浓度为0.1 g/ml和0.01 g/ml的AI对MDA?MB?468细胞的增殖未见明显影响。见表1。1 g/ml AI干预MDA?MB?468细胞，其对细胞增殖的抑制作用随时间的延长而逐步增强；0.1 g/ml AI在作用4 d时对细胞增殖有明显抑制作用，在作用1、6和7 d时对细胞增殖反而起促进作用，其余时间则对细胞增殖无明显影响。见表2。表1 AI干预MDA?MB?468细胞增殖的量效关系（略）表2 AI干预MDA?MB?468细胞增殖的时效关系（略）
2.2 AI对MDA?MB?468细胞超微结构的影响
1 g/ml AI作用于MDA?MB?468细胞后，可见大量胀大的坏死细胞，细胞膜破裂，胞质内容物外泄，但核膜完整。存活细胞的微绒毛较空白对照组细胞明显减少，细胞核内出现空泡结构，细胞器变化不大。0.1 g/ml AI作用于MDA?MB?468细胞后，除微绒毛较空白对照组细胞有所减少外，其他变化均不明显。空白对照组MDA?MB?468细胞的细胞核大，呈不规则型，具有深凹陷。核仁明显，胞浆内线粒体、内织网、高尔基体均较发达，胞膜有长且分支的微绒毛，微绒毛相当发达。见图1。
2.3 AI对MDA?MB?468细胞周期和凋亡的影响
空白对照组G0?G1期、G2?M期和S期的细胞比率分别为38.96%、42.90%和17.72%，细胞凋亡率为3.70%；1 g/ml AI处理组的对应数据分别为48.52%、25.24%、26.23%、17.24%；0.1 g/ml AI处理组的对应数据分别为44.61%、31.32%、24.07%、8.10%。结果提示不同浓度的AI可增加G0?G1期的细胞比率，降低G2?M期的细胞比率，并可促进细胞凋亡。其中高浓度的AI对细胞周期和凋亡的影响更大。
2.4 AI对mMSCs增殖的影响
与空白对照组相比，经1 g/ml AI作用2 d后，mMSCs的增殖明显受到抑制，但其抑制作用不及顺铂（30 μg/ml）。0.1 g/ml AI作用2 d后，能明显促进mMSCs的增殖。见表3。表3 AI对mMSCs增殖的影响（略）
2.5 AI对MDA?MB?468细胞培养上清LDH水平的影响
与空白对照组相比，1 g/ml和0.1 g/ml的AI以及30 μg/ml的顺铂作用2 d后，各组培养上清LDH水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。表4 AI对MDA?MB?468细胞培养上清中LDH水平的影响（略）
2.6 AI对MDA?MB?468细胞EGFR和p53蛋白表达的影响
经AI作用后，MDA?MB?468细胞EGFR蛋白表达减弱，胞浆和细胞膜棕黄色颗粒明显减少，平均光密度值为0.18±0.01，低于空白对照组的0.29±0.02（t=12.08，P<0.01）；p53蛋白的表达也减弱，细胞核内棕黄色颗粒明显减少，平均光密度值为0.17±0.01，低于空白对照组的0.33±0.01（t=24.84，P<0.05）。
3 讨 论
Basal?like乳腺癌是乳腺癌不同亚型中预后较差的一型［6］，这一亚型具有肿瘤体积大，ER、HER?2、p27 kip1低水平表达和细胞周期蛋白E（cyclin E）高水平表达，以及核p53高表达和肿瘤内血管巢等特性，并且这些因素都和不良预后相关［7］。由于该亚型ER和HER?2表达均为阴性，针对ER和HER?2的药物对该亚型疗效不佳。中医学认为，乳腺癌是在机体全身气血阴阳失调的基础上出现局部邪实为主要表现的恶性病变，相比于放疗和化疗的“敌我不分”，邪正俱伤，中医药在抗肿瘤复发转移的治疗中更注重扶正，具有整体调节和毒副作用小的特点。黄芪作为补虚药的代表药物，可以“补诸虚不足”，是我科在几十年乳腺癌临床治疗中应用最广泛的药物之一。有研究发现，黄芪能调整机体免疫功能［8］，影响环氧化酶?2、血管内皮生长因子和前列腺素E2的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖［9］。那么，除了间接的抗肿瘤作用之外，黄芪是否具有直接抗癌作用？应用剂量的不同是否会影响其抗肿瘤作用？
在本研究中，我们选择EGFR表达阳性和p53基因突变的basal?like乳腺癌MDA?MB?468细胞作为研究对象，考虑到体外实验的用药要求，选择市售的AI对其进行干预，观察AI对体外培养的MDA?MB?468细胞的增殖和凋亡的影响。CCK?8检测结果显示，AI浓度为1 g/ml时，对MDA?MB?468细胞的增殖有明显的抑制作用，并且这种抑制作用呈时效关系，随着时间的延长，抑制作用逐渐增强；而0.1 g/ml AI对MDA?MB?468细胞增殖的影响随时间的延长有所波动，作用不稳定。mMSCs又被称为间质干细胞，它具有多向分化的潜能，同时能分泌多种造血生长因子和多种细胞黏附分子，对维持造血也有很重要的作用。鉴于骨髓毒性是很多抗肿瘤药物的主要毒副作用之一，我们同时用相应浓度的AI干预原代培养的小鼠mMSCs，以了解黄芪在抗肿瘤的同时是否具有“祛邪不伤正”的作用。实验发现浓度为1 g/ml的AI对mMSCs的增殖也有抑制作用，但其抑制作用明显不如顺铂。而浓度为0.1 g/ml的AI作用2 d后，能明显促进mMSCs的增殖。表明AI对MDA?MB?468细胞和mMSCs增殖的影响与药物浓度有关，高浓度的AI对两者的增殖均有明显的抑制作用，而低浓度的AI则明显促进mMSCs的增殖。不同浓度的AI对MDA?MB?468细胞和mMSCs增殖的不同影响，可能是由于黄芪中存在多种含量不等的有效成分，这些成分的有效工作浓度亦有差别，造成在不同浓度的AI中发挥主要作用的有效成分各异，因此会出现AI浓度不同则实验结果不同甚至截然相反的情况。这种随药物浓度改变而出现不同作用的现象可能正是中药作用的特点与研究的难点。
同步监测MDA?MB?468细胞培养上清LDH水平，各用药组之间比较，差异无统计学意义，说明各用药组对细胞增殖的抑制作用与制剂工艺和理化因素无关。透射显微镜检测发现浓度为1 g/ml的AI作用后，细胞大量坏死，细胞膜破裂，胞质内容物外泄，但核膜完整。存活细胞的微绒毛较空白对照组细胞明显缩短、减少。提示AI可能作用于细胞膜，并对肿瘤细胞的侵袭性有一定的影响。流式细胞术的检测结果进一步表明AI可影响细胞周期，促进细胞凋亡。免疫细胞化学法的检测结果显示AI能显著下调EGFR和p53蛋白的表达。提示这可能是AI抑制肿瘤细胞增殖的作用途径之一。
本研究提示黄芪在basal?like乳腺癌的抗肿瘤治疗中具有“祛邪不伤正”或“少伤正”的作用，展示了黄芪在basal?like乳腺癌的综合治疗中具有良好的临床应用前景。同时，本研究发现黄芪抑制basal?like乳腺癌细胞株增殖的作用与药物浓度和作用时间有关，提示进一步开展黄芪抗肿瘤治疗的用药剂量和疗程的实验和临床研究是非常必要的。
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