调中颗粒对大鼠混合反流性食管炎的治疗作用及其机制
作者：时昭红, 苏文, 张介眉, 郝建军, 冯云霞, 陈洲
【摘要】 目的：观察调中颗粒对混合反流性食管炎大鼠食管黏膜病理改变及血清氧自由基的影响，探讨调中颗粒反流性食管炎的作用机制。方法：58只SD大鼠随机分成5组：调中颗粒组、半夏泻心汤组、西沙必利组、模型组和假手术组。通过食管十二指肠端侧吻合术法复制混合反流性食管炎大鼠模型，造模结束后灌胃给药，连续给药12 d后处死大鼠，HE染色法观察病理变化，免疫组织化学SABC法检测大鼠食管黏膜中肿瘤抑制蛋白质p53和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）的表达，比色法检测血清中丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH?Px）的活性。结果：治疗结束后，与模型组比较，调中颗粒组、半夏泻心汤组和西沙必利组大鼠食管黏膜组织病理改变有不同程度的修复。与模型组比较各治疗组血清MDA含量下降（P<0.05, P<0.01），SOD和GSH?Px活性升高（P<0.05, P<0.01），p53和PCNA表达减少（P<0.01）。调中颗粒在降低MDA含量、提高SOD和GSH?Px活性方面优于西沙必利片（P<0.05），减少PCNA和p53表达方面优于半夏泻心汤和西沙必利片（P<0.05）。结论：调中颗粒可以降低MDA的含量，提高SOD和GSH?Px的活性，减少PCNA和p53的表达，促进黏膜的修复，可能为其治疗反流性食管炎的作用机制。
【关键词】 食管炎, 反流性; 复方; 氧自由基; 增殖细胞核抗原; 肿瘤抑制蛋白质p53; 大鼠
Objective: To explore the mechanism of Tiaozhong Granule (TZG), a compound traditional Chinese herbal medicine, in treating rats with mixed reflux esophagitis.Methods: Fifty?eight SD rats were randomly divided into untreated group (n=12), sham?operated group (n=10), TZG?treated group (n=12), Banxia Xiexin Decoction (BXXXD)?treated group (n=12) and cisapride?treated group (n=12). Mixed reflux esophagitis was induced by esophago?duodenum end?to?side anastomosis. Four weeks later, the rats were orally administered twice daily for 12 days. Pathological changes of esophagus mucous membrane were observed by using HE staining. The expressions of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and p53 in the esophagus tissue were detected by immunohistochemical SABC method. Spectrophotometric method was used to detect the content of malondialdehyde (MDA) and the activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH?Px) in serum.Results: Compared with the untreated group, pathological changes of esophagus mucous membrane were relieved in different degrees in TZG?treated group, BXXXD?treated group and cisapride?treated group. Content of MDA and expressions of PCNA and p53 were obviously decreased in the three treated groups (P<0.01), and the activities of SOD and GSH?Px were significantly increased in the three treated groups (P<0.05, P<0.01). TZG had better effects than cisapride in decreasing the content of MDA and increasing the activities of SOD and GSH?Px (P<0.05). TZG was better in aspect of reducing the expressions of PCNA and p53 than BXXXD and cisapride tablets (P<0.05).Conclusion: Tiaozhong Granule can treat mixed reflux esophagitis in rats, and its action mechanisms may be associated with decreasing the expressions of PCNA and p53 in esophagus mucous membrane, reducing the content of MDA and increasing the activities of SOD and GSH?Px in serum.
Keywords: esophagitis, reflux; compound recipe (TCD); oxygen radicals; proliferating cell nuclear antigen; tumor suppressor protein p53; rats
反流性食管炎（reflux esophagitis, RE）是一种以胃肠内容物反流入食管造成黏膜损伤为特征的常见消化道疾病。近年来其并发的Barrett食管（Barrett's esophagus, BE）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）的发病率有增高趋势［1］，但目前该病的西药疗效尚不能令人满意。调中颗粒（Tiaozhong Granule, TZG）原名胃必欢，是临床运用20余年，已通过湖北省食品药品监督管理局院内制剂审批（批准文号：鄂药制字2005第z01?112号）的治疗RE的经验方剂，为进一步探讨其疗效及作用机制，我们在成功建立混合RE大鼠模型的基础上，观察调中颗粒对食管黏膜的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物
清洁级健康SD大鼠，雌雄各半，体质量（180±20）g。由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供（合格证号：19?058；编号：TJLA?2005?308）。
1.1.2 药物
调中颗粒（姜半夏10 g、黄连6 g、黄芩8 g、炮姜3 g、太子参15 g、甘草6 g、大枣10 g、杏仁10 g、厚朴10 g）由武汉市中西医结合制剂室提供（批号：05?04?08），6 g/袋，用蒸馏水稀释成浓度为2 g/ml的溶液(按颗粒剂)。半夏泻心汤（半夏12 g，黄芩、干姜、党参、炙甘草各9 g，黄连3 g，大枣4枚）药物及制剂（制备成浓度为1.74 g/ml的汤剂，按生药计算）由武汉市中西医结合医院制剂室提供（批号：05?06?07）。西沙必利片，5 mg/片，由西安杨森制药有限公司生产（国药准字H1096289，批号：040521939），用蒸馏水稀释成0.02 mg/ml的溶液。
1.1.3 主要仪器与试剂
BX?60型Olympus光学显微镜和Olympus BX?50显微摄影系统由日本奥林巴斯公司生产；HUMIAS?2000医学图文分析系统由武汉千屏影像技术有限责任公司提供；TU?1800S型紫外分光光度计由北京普析通用公司生产；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH?Px）试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供；鼠抗人肿瘤抑制蛋白质p53单克隆抗体、鼠抗人增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）单克隆抗体、SABC免疫组化染色试剂盒及二氨基联苯胺（diaminobenzidine, DAB）显色试剂盒均由武汉博士德生物工程有限公司提供。
1.2 实验方法
1.2.1 分组及喂养
考虑动物模型复制过程中动物有一定的死亡率［1］，酌情调整各组大鼠数量。58只SD大鼠运用随机数字表随机分组，调中颗粒组、半夏泻心汤（Banxia Xiexin Decoction, BXXXD）组、西沙必利组和模型组，每组12只，假手术组10只。分笼饲养于钢丝网底塑料笼内，每笼4只，每组3笼，自由取食。
1.2.2 混合反流性食管炎模型的建立
造模方法参照王雯等［2］的食管十二指肠端侧吻合术法。大鼠适应环境4～7 d后，用1%戊巴比妥钠麻醉（30 mg/kg，腹腔注射），将大鼠固定于手术台，取上腹部正中切口进腹。进腹后将食管下段分离出神经和血管，结扎贲门，切断食管，缝合贲门并荷包包埋入胃中，保留全胃。于距幽门约1 cm处纵行切开十二指肠壁约0.5 cm，与食管下端行食管十二指肠端侧吻合术，关腹前腹腔内注入生理盐水1 ml及硫酸庆大霉素2万U。术后禁食24 h，不禁水。观察大鼠饮食、粪便及活动情况。假手术组行假手术，进腹后将食管下段分离出神经和血管后关腹。造模时间为4周。造模过程中因部分大鼠不能耐受实验而死亡，造模结束时调中颗粒组、半夏泻心汤组、西沙必利组、模型组、假手术组分别剩余10、9、8、9、10只大鼠。
1.2.3 给药与取材方法
造模成功24 h后开始灌胃给药，调中颗粒组予调中颗粒10.03 g/(kg·d)、半夏泻心汤组予半夏泻心汤8.71 g/(kg·d)，西沙必利组给予西沙必利片0.09 mg/(kg·d)，假手术组和模型组给予同体积的生理盐水灌胃，每天2次，共给药12 d。给药结束后禁食不禁水12 h，心脏取血，置于5 ml的抗凝采血管中，3 500 r/min，离心10 min，取上清备用。自胃食管交界部位向上1 cm处（向咽喉方向）取一段长约1 cm的食管，固定于10％福尔马林中，HE染色后光镜观察病理改变。同时取食管下端大小约为0.5 cm×0.5 cm食管壁全层一块，立刻置于4 ℃ 4%的多聚甲醛中固定2 h，用于免疫组化检测。
1.2.4 观测指标和方法
1.2.4.1 血清中MDA含量和SOD、GSH?Px活性检测
采用比色法，具体操作步骤按试剂盒说明进行。
1.2.4.2 食管黏膜中PCNA和p53表达的检测
采用SABC法，具体操作步骤按试剂盒说明进行。染色结果判定标准均以细胞核有明确棕黄或褐色着色而胞质不着色为阳性细胞。通过BX?60型Olympus光学显微镜（×400倍）观察食管黏膜中PCNA和p53免疫阳性细胞的分布，每张切片随机选取5个视野，用HUMIAS?2000医学图文分析系统分析食管黏膜中PCNA和p53阳性细胞的灰度值。PCNA和p53含量与灰度值呈正比，灰度值越大，表示PCNA和p53含量越多。
1.2.4.3 病理变化
参照1999年8月全国反流性食管病（炎）研讨会制定的“反流性食管病（炎）诊断及方案（试行）”中反流性食管炎分级标准：鳞状上皮增生、黏膜固有层乳头延伸、上皮细胞层内炎细胞浸润为轻度；轻度基础上出现黏膜糜烂为中度；轻度基础上有溃疡形成和（或）Barrett食管改变为重度［3］。
1.3 统计学方法
计量资料实验数据以x±s表示，采用单因素方差分析，组间比较用q检验；等级资料的假设检验采用Ridit分析。应用SPSS 13.0统计软件分析数据。
2 结 果
2.1 大鼠食管黏膜组织病理改变
造膜6周后假手术组大鼠食管黏膜上皮完整，基底侧的结缔组织呈乳头状突向上皮；调中颗粒组大鼠食管黏膜基本正常；西沙必利组大鼠食管黏膜固有层乳头延伸，仍有炎细胞浸润，多数属于轻度改变；半夏泻心汤组大鼠食管黏膜基本修复，细胞排列紊乱；模型组大鼠食管黏膜鳞状上皮增生，黏膜固有层乳头延伸，出现炎细胞浸润，黏膜糜烂，有溃疡形成，多数属于重度改变。见图1。经过Ridit分析，模型组和假手术组大鼠食管黏膜病理分级比较差异有统计学意义（P<0.01）。模型组病理分级和西沙必利组、半夏泻心汤组、调中颗粒组病理分级比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。表1 各组大鼠食管黏膜病理改变分级（略）
2.2 血清MDA含量和SOD、GSH?Px活性
与假手术组比较，模型组大鼠血清MDA含量增加，SOD和GSH?Px活性下降，差异有统计学意义（P<0.01）；各治疗组MDA含量和SOD、GSH?Px活性与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05, P<0.01）；调中颗粒组与西沙必利组、半夏泻心汤组比较，调中颗粒组SOD、GSH?Px活性升高，差异有统计学意义（P<0.05, P<0.01）；调中颗粒组MDA含量低于西沙必利组（P<0.05)，但与半夏泻心汤组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。表2 各组大鼠血清MDA含量以及SOD和GSH?Px活性（略）
2.3 食管黏膜中PCNA和p53阳性物质表达
与假手术组比较，模型组PCNA和p53表达增多，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，各治疗组PCNA和p53的表达降低（P<0.01）。与西沙必利组比较，调中颗粒组PCNA和p53的表达下降，差异有统计学意义（P<0.05）。半夏泻心汤组PCNA和p53的表达高于调中颗粒组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2、图3和表3。表3 各组大鼠食管黏膜中PCNA和p53的表达（略）
3 讨 论
RE是由胃和十二指肠内容物，主要是酸性胃液或酸性胃液加胆汁反流至食管所引起的食管黏膜的炎症、糜烂等病变。长期反复反流还可导致食管溃疡、BE和EAC等，这些病变的主要表现为黏膜上皮细胞增生过度及异常，与局部生成过多的氧自由基，出现氧化应激，导致基因突变密切相关［4］。正常的食管鳞状上皮细胞大多数处于静止状态，各种反流物对食管黏膜的刺激损伤导致氧化应激活跃，产生大量氧自由基，攻击生物膜形成一系列脂质过氧化产物及其降解产物MDA等，从而启动内源性酶类抗氧化剂SOD和GSH?Px的清除机体自由基、中和与减轻活性氧毒性的功能［5］。本实验结果显示模型组大鼠MDA含量增加，SOD和GSH?Px活性下降，这可能是胃十二指肠内容物反流造成食管黏膜损伤导致氧化应激活跃的结果。调中颗粒可明显降低血中MDA的含量，且作用优于西沙必利（P＜0.05），同时还可提高SOD和GSH?Px的活性，且作用优于半夏泻心汤（P＜0.05）。这可能与其组方有关。
调中颗粒是在半夏泻心汤的基础上加减而成的经过临床验证的有效中药制剂，以姜半夏为君，降逆之功极佳，臣以炮姜、黄芩、黄连辛开苦降，佐以太子参、大枣甘温益气，以恢复气机升降功能和机体抗邪能力，又加入杏仁、厚朴苦温下气，助肺气肃降以利胃气和降。因此调中颗粒可能是通过降逆而减少内容物的反流，减弱氧化应激活动，从而提高组织局部抗氧化能力而发挥黏膜保护作用。
由于最近研究发现氧化应激可能导致基因突变，从而并发BE和EAC［5,6］，因此我们还运用免疫组化法观察了调中颗粒对PCNA和p53表达的影响。PCNA是一种在细胞增殖周期中广泛表达的核内蛋白质，目前公认为是评价细胞增殖活性的重要指标。食管正常上皮PCNA免疫阳性物质相对较少，RE黏膜中PCNA免疫阳性物质增多，在不典型增生的黏膜中PCNA免疫阳性物质明显增多。因此，PCNA的阳性表达在EAC和反流性食管炎，尤其在EAC和BE中具有重要的作用［7,8］。p53基因有野生型与突变型，用免疫组化染色方法检出的是突变体的p53基因表达，是一种癌基因［9,10］。从正常食管黏膜到RE再到非典型增生，p53的阳性率逐渐增加。且p53阳性率的变化和PCNA阳性物质的增加一致［11,12］。
本研究显示模型组大鼠的食管PCNA和p53表达高于正常组。说明PCNA和p53表达增多与RE有密切关系，干预治疗可以影响PCNA和p53的表达，各组都可使PCNA和p53表达减少，调中颗粒与西沙必利片相比无明显差异，调中颗粒对PCNA和p53表达的抑制作用优于半夏泻心汤（P＜0.05）。但干预治疗后病理组织切片光镜下恢复正常的食管黏膜的PCNA和p53蛋白的表达仍显著高于假手术组。提示该食管黏膜虽然形态已恢复正常，但其分子水平尚未达到正常水平，这可能就是RE复发的分子生物学基础。
RE属中医“吞酸”范畴，胃气上逆是其基本病机，酸水泛溢是其病理关键。我们选择西沙必利片为西药对照药，是因为西沙必利片是全消化道动力药，可增加食管下端括约肌压力从而起到抗反流作用，作用机制与中医降逆制酸相似，同时选用与其组方相近的半夏泻心汤作为中药对照组，实验结果表明调中颗粒在降低氧自由基的损伤、抑制PCNA和p53的表达上均优于半夏泻心汤，综合疗效显著。可见调中颗粒诸药合用和胃、降逆、制酸，从而减轻以酸为主的十二指肠内容物反流对食管黏膜的损伤，保护食管黏膜的完整性。其具体作用机制可能是通过减少氧化损伤，从而减少食管鳞状上皮抑癌基因p53突变为致癌基因，阻止食管黏膜组织由炎症向腺上皮化生，抑制细胞增殖，减少PCNA表达，从而提高食管的黏膜屏障保护作用，改善临床症状。
【】
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