LAMP快速检测沙门菌invA基因的方法建立与应用
【摘要】 目的：建立一种环介导等温扩增(loop?mediated isothermal amplification，LAMP)反应快速检测沙门菌的方法。方法：根据美国国立卫生研究院基因序列数据库(GenBank)上的鼠伤寒沙门菌的特异invA和fimA(登录号：M90846和M18283)基因序列，设计特异引物，提取标本DNA，然后以LAMP技术扩增invA基因，PCR方法扩增fimA基因，采用琼脂糖电泳观察结果。结果：91份血培养阳性报警瓶，LAMP和PCR法检测出阳性18份，与最终培养结果一致；30份粪便标本，LAMP和PCR法检测出阳性5份，培养阳性3份，LAMP测限达到102CFU／mL。结论：LAMP是一种简便、快速、特异和敏感的检测临床和环境标本中沙门菌的有效方法。
【关键词】 沙门菌 环介导等温扩增（LAMP） 核 酸
沙门菌(Salmotlella)是肠杆菌科中一种重要的人兽共患病病原菌，是引起伤寒、肠炎等多种疾病的重要病原菌。目前，对于沙门菌的检测普遍采用培养、生化和血清学鉴定等方法，报告阳性结果至少需要3～5天，且较为繁琐、费时费力。而酶联免疫吸附试验、肥达试验、凝集试验、免疫电泳、PCR等方法均存在对检测标准的特殊要求以及特异性方面的不理想等因素[1,2]。我们应用环介导等温扩增（LAMP）反应快速检测沙门菌，报道如下。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器 核酸扩增仪（MyGetle Thermal Cycler，杭州朗基仪器有限公司)，Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)，PCR试剂盒(Takara公司)，得灵Walkaway?96全自动细菌鉴定仪，BacT/Alert全自动血培养仪及其配套的血培养瓶(法国生物梅里埃公司产品)。
1.2 标本和菌株来源 91份阳性血培养瓶和30份粪便标本均来自温州医学院附属第二细菌室。鉴定特异性的参照菌株除标准ATCC菌株购自卫生部临床检验中心，其它菌株均为温州医学院细菌室临床鉴定菌株。
1.3 引 物 针对鼠伤寒沙门菌的invA和fimA基因(GenBank登录号：M90846和M18283)分别设计特异LAMP和PCR特异引物(上海生工合成)。
1.4 阳性血培养瓶中细菌DNA模板提取 采取盐酸胍?苯甲醇法[3]：①从阳性血培养瓶中以无菌方式取100μl培养物置入1．5ml的EP管中，然后加入5M盐酸胍缓冲液100μl，涡旋振荡5min；②依次加入400μl双蒸水和800μl苯甲醇，涡旋振荡1min，然后在4℃下以700×g离心5min；③取上层水相约0.4ml到一新Ep管，依次加入3M醋酸钠缓冲液40μl和异丙醇0．44ml，然后在4℃T 16，000×g离心15min；④倒掉上层液体，加入1ml 70％乙醇洗涤，然后在4℃T 16，000×g离心10min，接着倒掉上层的乙醇，待干燥后加入100μl双蒸水溶解管底的DNA沉淀备用。
1.5 粪便标本细菌DNA直接提取 按照[4]进行。
1.6 绵羊血琼脂平板上菌株的DNA提取 挑取1个以上纯菌落置入内含100μl裂解液(蛋白酶K浓度为200ng／ml的0．5％NP?40溶液)的0．5ml离心管内，56℃水浴1小时，95℃水浴消化15min，然后14，000r／min，离心30秒，上清液即为PCR扩增检测的模板液。
1.7 标本检测 对阳性血培养瓶和粪便培养标本提取的细菌DNA进行LAMP和PCR检测，并同时对上述标本进行传统方法鉴定，根据沙门菌分型抗血清和生化鉴定结果确诊沙门菌。LAMP反应体系(25μl)中包括1.6μmol／L的引物FIP和BIP,0.2μmol／L的引物F3和B3，1.2mmol／L的dNTP，4mmol／L MgSO4，1×thermopol buffer(New EnglandBiolabs)，0.8mol／L betaine和2.5μl的模板，反应条件为：先95℃ 5min，然后冰上冷却，再加入8U Bst DNA聚合酶1μl，63℃恒温1小时，最后80℃，3min终止反应。PCR反应体系(25μl)条件为：0.2mmol／L的dNTP、1．25 U的Taq酶0．4μmol／L的正反向引物、1．5 mmol／L的Mg2+和3．0μl的模板。反应条件为：先94℃2min，再按94℃1min→52℃ 30s→72℃1min，共30个循环；最后72℃ 10min。两种方法产物分别在含溴化乙啶的2％琼脂糖中电泳后，用凝胶成像系统观察结果并照像。
1.8 特异性和最低检测限分析 将由参照菌株提取的DNA进行LAMP和PCR扩增，以检测特异性；将临床鉴定鼠伤寒沙门菌接种于绵羊血琼脂平板过夜培养，然后挑取菌落制备一系列浓度的菌悬液提取模板DNA，最后以LAMP和PCR扩增各浓度模板中的相应特异基因。
2 结 果
2.1 临床标本的检测 在91份阳性培养瓶标本中，传统方法、LAMP和PCR法均检测到18株沙门菌，且均是相同标本；30份粪便标本，经培养有3份阳性，而LAMP和PCR法均检测到5份阳性。经统计χ2=0．18(P>0．1)，LAMP法与培养法的总体符合率为93．4％，见表1；琼脂糖电泳图，见图1～3。表1 三种沙门菌检测方法比较份
2.2 特异性检测 参照菌株通过LAMP和PCR扩增后，均没有发现任何扩增产物，见表2。表2 LAMP和PCR引物的特异性试验使用菌株
2.3 最低检测限分析 PCR法检测fimA基因的最低菌液浓度为104CFU／mL，而LAMP扩增invA基因可以达到102CFU／mL，见图4。M：100bp DNA Mrdrker；1～8：108?101CFU／mL
3 讨 论
沙门菌的特异性引物基因一般分为属特异性、血清群特异性和血清型特异性三类。目前多数研究人员都是使用属特异性引物基因用以检测沙门菌，如invA和fimA等基因。Huguette[5]等证明了27个血清群中的80种血清型沙门菌均存在，fimA基因，具有相当保守性。沙门菌invA基因是编码吸附和侵袭上皮细胞的表面抗原，Boyd[6]等对invA基因多态性分析发现，invA基因与看家基因有相当的保守性。Boilay?chuk[7]等用荧光定量方法检测沙门菌invA基因，也发现其检测效果与培养方法一致。本试验中根据两种基因所设计的引物序列，也得到了很好的特异性结果。
LAMP技术是Notomi[8]等在2000年提出的一种新的核酸扩增技术，采用2对引物来识别目标基因的6个不同区段，通过链置换反应和两个环介导实现等温条件下基因快速扩增，具有扩增反应快(一般在1小时内完成)、灵敏度高、特异性强、不需要昂贵的仪器(恒温水浴锅即可)等优点，扩增产生的产物量大，形成白色的焦磷酸镁盐沉淀，结果的观察也十分方便，甚至可用肉眼观察产生浊度的反应管即为阳性[9]。还可以加入Syber Green I或者溴化乙锭等荧光染料，通过直接观察荧光来判断是否有扩增产物出现。目前，分子生物学方面的核酸扩增技术已经非常成熟，但PCR检测方法需要精密、昂贵的扩增仪器，且存在一些干扰检测结果的因素，故未被应用于广大基层医疗和食品保健等单位。LAMP方法与传统方法相比虽然没有明显阳性率检出优势，但有操作简单、快速，特异性高等特点，因而此项技术值得基层医疗单位进一步推广，也可作为基层防疫部门对饮食业环境以及食品安全监测的快速初筛试验，在流行病学上有重要意义。
本研究中经传统培养方法确诊的来自血培养18株沙门菌和粪便培养的3株沙门菌均可以通过LAMP和PCR方法扩增出来，并且两种核酸扩增方法在粪便培养标本中多检测出2株沙门菌，这可能与分子生物学的高灵敏度以及培养时取材的量和位置有关。最终培养证实上述21株菌株分属沙门菌A?D群。但对于粪便标本来说，值得注意的是部分沙门菌可以伴随人体粪便而持续分泌数月到数年之久，故对于检出结果临床上要慎重对待，不应认为检出沙门菌即要给予抗生素，而应根据病人症状来判断是否为沙门菌感染，或仅是携带者。
有资料[10]显示，至2002年已收录2541个沙门菌血清型，所以还有很多的沙门菌血清型未得到证实，还有待进一步研究。但通过本试验，可以将LAMP方法作为一种伤寒、副伤寒快速诊断的可行性依据。本实验方法从感染标本以及沙门菌菌落中提取DNA均能直接检测，特异性、敏感性高。
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3 David NF，David AR．Improved amplification of microbial DNA from blood cultures by removal of the PCR inhibitor sodium polyanetholesulfonate．J Clin Microbiol，1998，36：2810?2816
4 Ittisak Subrungruang，thirut Mungthin，Porntip Chavalitshewinkoon?Petmitr，et al．Evaluation of DNA extraction and PCR methods for detection of enterocytozoon bienuesi in Stool specimens．J Clin Microbiol，2004，42(8)：3490?3494
5 Popoff MY,Bockemuhl J，Gheesling LL．Supp lemem 2002(no．46)to the Kauffmann?White scheme.Res Microbiol，2004，155：568?570
6 Boyd EF，Li J，Ochman H，et al．Comparative Genetics of the inv?spainvasion gene complex of salmonella enterica．J Bacteriol，1997，179(6)：1985?1991
7 Bohaychuk VM，Gensler GE，McFallME，et al．A real?time PCR assay for the detection of Salmonella in a wide variety of food and food?animal matricest．J Food Prot，2007，70(5)：1080?1087
8 Notomi T,Okayama H，Masubuchi H，et al．Loop?mediated isothermal amplification of DNA．Nucleic Acids Res,2000，28(12):63
