右归丸对骨髓抑制小鼠造血功能的影响

                        作者：郑轶峰 张力华 秦剑 石娅萍 周毅  

【摘要】  目的：观察右归丸对骨髓抑制小鼠外周血、造血干细胞增殖能力、骨髓细胞周期和凋亡的影响，并探讨其可能作用机制。方法：小鼠48只，随机分为正常组、模型组，右归丸低、中、高剂量组和阳性对照组，每组8只。除正常组外，余五组均予造模，连续3天给予腹腔注射环磷酰胺制备骨髓抑制模型。造模后各组应用相应药物7天。用全自动血细胞分析仪、白细胞计数法、造血祖细胞培养和流式细胞术(FCM)分别检测右归丸对骨髓抑制小鼠外周血、骨髓有核细胞数、体外培养各系造血祖细胞的集落数以及骨髓细胞周期和凋亡的影响。结果：右归丸中、高剂量均能明显升高外周血红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)、骨髓有核细胞(BMC)数，高剂量对血小板(PLT)和白细胞(WBC)有明显升高作用。右归丸能明显提高体外培养各系造血祖细胞的集落数，以中、高剂量效果显著。右归丸低、高剂量均能促进骨髓G0/G1期细胞向S期细胞以及S期细胞向G2/M期细胞的转化，提高G2/M期细胞比例，增殖指数(PI)明显升高。右归丸中、低剂量组的骨髓细胞凋亡比例显著下降。结论：右归丸可能通过促进G0期造血干细胞进入细胞周期，进行增殖；加速骨髓细胞修复受损的DNA，通过G1/S和S期监测点；抑制造血细胞的凋亡；调节造血细胞增殖与凋亡之间的平衡等机制，从而促进损伤骨髓造血功能恢复。

【关键词】  小鼠 骨髓抑制 右归丸 细胞周期 凋亡 细胞培养

右归丸出自明代张景岳的《景岳全书》，由熟地、制附子、肉桂、山药、山茱萸、菟丝子、枸杞、鹿角胶、杜仲、当归等药组成，为温补肾阳的代表方剂，具温补肾阳、填精益髓之功效。本研究采用60Co伽马射线和环磷酰胺(CTX)联合制作骨髓抑制小鼠模型，观察右归丸对骨髓抑制小鼠外周血细胞、骨髓有核细胞数、造血干细胞增殖能力、骨髓细胞周期及细胞凋亡的影响，为其在临床上的进一步应用提供理论依据。

    1  材料和方法 

    1．1  材  料  8～12 周龄BALB／c纯系雄性小鼠48只，体质量18～22g(四川大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：川实动管字09号)；右归丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号：8013042)，使用前用生理盐水配制成相应浓度的溶液；环磷酰胺（山西普德药业有限公司，批号：20080106)；重组人粒细胞集落刺激因子注射液(特尔津，厦门特宝生物工程股份有限公司，批号：200807820)；碘化丙啶(PI)荧光染液(美国Sigma公司)；60Coγ射线放射源(四川省肿瘤放疗科提供)；全自动血细胞分析仪BC?3000 Plus型(深圳迈瑞生物医疗股份有限公司)；流式细胞仪(EPICS XL型，Beckman?Coulter公司)。

    1.2  方  法 

    1．2．1  骨髓抑制动物模型的制备  参照严苏纯[1]等介绍的方法造模。小鼠经2.0Gy的60Co照射后第4天开始，每天腹腔注射环磷酰胺(CTX)50mg/kg(于临用前配制)，连续给药3天完成模型制备。

    1.2.2  动物分组与给药  将小鼠随机分为正常组，模型组，右归丸低、中、高剂量组和阳性对照组，每组8只。除正常组外，其余五组均进行造模。小鼠造模完成的第2天开始给药，正常组和模型组每只灌胃0．2 ml/（10g·d）的生理盐水；右归丸低、中和高剂量组分别给右归丸浓度为2.25g/kg、4.5g/kg和9.0g/kg，每只小鼠灌胃0.2 ml／(10g·d)；阳性对照组每天腹腔注射重组人粒细胞集落刺激因子(G?CSF)150μg/kg，共给药7天。

    1.2.3  外周血细胞计数  最后一次给药后24小时，经小鼠眼球后静脉丛采血0．1 ml，用BC?3000 Plus型全自动血细胞分析仪进行血常规检测。

    1.2.4  骨髓有核细胞悬液的制备  最后一次给药后24小时，以颈椎脱臼法处死各组小鼠，取出股骨，剔除肌肉和结缔组织，剪开股骨两端，用6号针头以生理盐水液冲出骨髓细胞，再用4号针头过滤制成单个骨髓细胞悬液。取部分骨髓细胞悬液在显微镜下按白细胞计数法进行骨髓有核细胞计数。

    1.2.5  造血祖细胞培养  在最后一次给药后24小时，颈椎脱臼处死各组小鼠，75％酒精浸泡消毒，无菌条件下取出股骨，方法[2,3]，按本实验室常规培养方法做粒系(CFU?GM)、红系(CFU?E、BFU?E)和巨核系(CFU?Meg)三系造血祖细胞集落培养，每组培养6孔。培养第3天于倒置相差显微镜下计数CFU?E细胞集落数，培养第7天分别计数BFU?E、CFU?GM和CFU?Meg细胞集落数。

    1.2.6  细胞周期样品制备  将上述单个骨髓细胞悬液离心（1000 r/min，5min)，弃上清，NPBS洗涤2次，去上清液，滴入70％冷乙醇固定细胞，立即混匀，用封口膜封口，放置4℃冰箱冷藏备用。

    1.2.7  细胞周期分析和凋亡细胞测定  取上述70％冷乙醇固定的细胞样品，用PBS洗2次，以洗去残留的乙醇，加100μl PBS后混匀，加碘化丙锭染液1ml染色30min(4℃，避光30min)，上流式细胞仪检测细胞周期变化和凋亡细胞比例。结果以细胞周期各时相细胞百分率表示，并按公式：PI＝(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100％细胞增殖指数(proliferation index，PI)。

    1．3  统计学方法  实验所得数据用(±s)表示，各组数据先行方差齐性检验，再进行单因素方差分析，α=0．05。

    2  结  果 

    2.1  对骨髓抑制小鼠外周血及骨髓有核细胞的影响  与正常组比较，模型组白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、骨髓有核细胞均明显降低(P<0．01)。与模型组比较，右归丸中、高剂量组的红细胞、血红蛋白、骨髓有核细胞均明显增高(P<0．05)，右归丸高剂量组的白细胞和血小板明显高于模型组(P<0．05)。和阳性组相比，右归丸各剂量组的白细胞和骨髓有核细胞均低于阳性组(P<0．01)，红细胞、血红蛋白、血小板与阳性组比较无统计学差异(P>0．05)；右归丸高剂量组骨髓有核细胞计数明显高于低剂量组(P<0．05)，见表1。表1  右归丸对骨髓抑制小鼠外周血及骨髓有核细胞的影响

   2.2  对骨髓抑制小鼠造血祖细胞培养的影响  与正常组比较，模型组各系集落产率明显降低(P<0．01)。与模型组比较，各药物组小鼠体外培养各系造血祖细胞的集落产率均有提高，右归丸中、高剂量组间差异有显著性意义(P<0．05)；与低剂量组比较，左归丸中剂量、高剂量组各系造血祖细胞集落产率增加，呈量效正相关，见表2。表2  右归丸对骨髓抑制小鼠造血祖细胞培养的影响

　　2．3  对骨髓抑制小鼠骨髓细胞周期和凋亡的影响  与模型组比较，其余各组G0/G1期细胞比例均有不同程度降低，除中剂量组外，差异均有显著性意义(P<0．05)。各组S期细胞比例高于正常组，除模型组和中剂量组外，其余各组均有统计学差异；除右归丸中剂量组外，各药物组S期细胞比例高于模型组(P<0．01)。各组G2／M期细胞比例均低于正常组(P<0．01)，各药物组G2/M期细胞比例均高于模型组(P<0．01)。 除中剂量组外， 各药物组增殖指数与模型组比较均有所提高， 且有统计学意义(P<0．01)。 与正常组比较， 各组凋亡细胞比例明显升高(P<0．01)；和模型组比较，各药物组凋亡细胞比例均降低， 除高剂量组外， 均有统计学意义，见表3。表3  右归丸对骨髓抑制小鼠骨髓细胞周期和凋亡的影响

　　3  讨  论 

    目前，对恶性肿瘤患者放化疗所致骨髓抑制所引起的白细胞减少症，临床多用重组粒细胞集落刺激因子(G?CSF)，虽然疗效确切，但作用时间短，价格昂贵，且有发热、骨痛等不良反应。有报道指出，部分实体肿瘤细胞能够分泌CSFs和／或表达相应受体[4]，外源性G?CSF也许会增加CSFs受体阳性肿瘤的转移率和局部复发率[5]，从而对G?CSF应用的安全性提出置疑。本实验初步探讨右归丸对放化疗小鼠骨髓造血功能的影响。实验结果显示，与正常组比较，模型组小鼠外周血和骨髓有核细胞数均明显降低，说明模型成功。与模型组比较，右归丸对外周血白细胞、红细胞、血红蛋白和血小板均有影响，用药7天后，其骨髓细胞数明显增加，外周血三系细胞成分都有不同程度地升高，以中、高剂量效果明显，并且有剂量依赖关系。以上结果表明，右归丸可较明显促进放化疗骨髓抑制的小鼠造血细胞功能的恢复。

    血细胞起源于骨髓产生的造血干细胞，正常生理状态下，90％～99．5％的造血干细胞处于细胞周期的静止期(G0期)，只有少数造血干细胞处于增殖状态便能维持机体恒定造血。在某些病理状态下，处于G0期的造血干细胞被激活，进入细胞周期并且加速自身复制和分化成熟，恢复血细胞的数量[6]。但是由于放化疗损伤骨髓后引起骨髓细胞凋亡增加、干细胞耗竭以及增殖能力下降等原因，骨髓各系CFU的形成能力下降明显[7]。本实验表明，小鼠受放化疗损伤后，骨髓中各系造血祖细胞集落的数量减少，而右归丸中、高剂量可以使模型小鼠体外培养各系造血祖细胞的集落产率有明显提高，从而改善骨髓抑制状况。

    在细胞周期调控中，有两个重要的监测点，分别位于G1与S期和G2与M期之间[8]。处于增殖期的骨髓细胞对放化疗损伤最为敏感。研究证实，细胞周期中S期对放射线敏感性最低，其次是G0/G1期，G2／M期敏感性最强[9]。放化疗造成造血细胞DNA损伤后，激活细胞周期监测点机制，将细胞周期阻滞于G1期修复损伤DNA，对不能修复者启动凋亡程序消除受损细胞[10]。所以，细胞周期各个时相的分布情况和凋亡细胞的比例能够反映骨髓细胞受损和恢复的程度。本实验采用流式细胞术对骨髓细胞周期进行分析后，发现模型组G0／G1和S期细胞比例高于正常组，G2／M期比例和增殖指数明显低于正常组，而凋亡比例明显高于正常组，表明放化疗不但引起G1期阻滞，而且造成S期阻滞，并通过促进细胞凋亡而导致骨髓抑制，这与报道一致[11]。与模型组比较，右归丸各剂量组G0/G1期比例显著下降，S期细胞比例和G2／M期细胞比例明显增加，增殖指数提高，而凋亡比例下降，表明右归丸可能通过加快损伤DNA修复，解除细胞周期阻滞，使受阻滞的各期细胞加速通过G1／S和S期监测点，可能还包括G2／M监测点，同时抑制细胞凋亡，恢复造血细胞的数量。进一步研究各组之间增殖指数和凋亡比例的关系发现，与模型组的低增殖指数和高凋亡率以及阳性组的高增殖指数和低凋亡率不同，随着右归丸各剂量组之间增殖指数的增加，其凋亡细胞的比例也有所增加，这表明右归丸可能通过调节造血细胞增殖与凋亡之间的平衡，修复放、化疗骨髓抑制小鼠的造血功能。

    综上所述，本实验结果提示右归丸可能通过促进G0/G1期的造血细胞修复受损的DNA，加速通过G1／S和S期监测点；抑制造血细胞的凋亡；调节造血细胞增殖与凋亡之间的平衡等机制促进放、化疗骨髓抑制的小鼠造血功能恢复，提高外周血象。

【文献】
  1 严苏纯，祝彼得，陈志伟．几种骨髓抑制性贫血小鼠模型的比较研究．成都中医药大学学报，2007，30(1)：31?33

2 杜卓民．实用组织技术．第2版，北京：人民卫生出版社，1999.228?232

3 徐有恒，王绮如．造血生和造血细胞检测技术．长沙：湖南技术出版社，1997.326

4 Nobuko T，Jun Y,Kolchi T，et al．Granulocyte?macrophage colony stimulating factor stiumlates tumor invasiveness in squamous cell lung carcinoma．Cancer，1998，82：2173

5 Ichiro N，Shigeharu F，Toshio O，et al．Granulocyte colony?stimulating factor enhances invasive potential of human llead and neck carcinoma cell lines．Int J Cancer，1999，80：78

6 张之南，单渊东．协和血液病学．北京：协和医科大学出版社，2004.12?14

7 Herodin F，Bourin P，Mayol JE.Short?term injection of antiapoptotic cytokine combinations soon after lethal?irradiation promotes survival．Blood,2003,101(7)：2609?2616

8 Israels ED，Israels LG.The cell cycle．Stem cell，2001，19(1)：88?91

9 Denenkamp J.Cell kinetics and radiation biology．Radiat Biol，1986，49(8)：357?362

10詹启敏．分子肿瘤学．北京：人民卫生出版社，2005.322?326

11鞠桂芝，马淑梅，傅士波．辐射对小鼠骨髓细胞周期的影响及其分子机理.中华放射医学与防护杂志，2002，22（5）：342?343