中草药治疗骨肉瘤的基础研究进展

                          作者：朱均 吴智南 徐卫东 陈俊

【关键词】  骨肉瘤 中草药 研究进展

骨肉瘤是高度恶性的间叶组织肿瘤，其特点是恶性肉瘤基质细胞产生骨样基质。骨肉瘤好发于青少年和年轻成人，约占儿童肿瘤的5%，骨肉瘤在局部呈侵袭性生长并且易发生转移。上，对骨肉瘤的评估和主要是患部及胸部X线平片和截肢[1]，用这种方法治疗只有10％～20%的患者能够长期存活[2]。近20年来，对骨肉瘤的诊断和治疗取得了巨大的进步。利用先进的影像技术（CT和MRI）能够清晰地显示肿瘤的局部解剖情况、生长方式和发现隐匿的肺转移灶。同时，经过改良的分级系统有助于判断患者的预后。多药联合化疗极大地提高了患者的长期生存率和施行保肢术的可能性。其他方面的进步，如假体的设计和对异体骨使用经验的积累等，使肢体骨肉瘤患者的保肢手术率提高至90％～95%，但骨肉瘤总体5年生存率只有60％～70%[3]。中医积累了不少诊治骨肉瘤的经验，为进一步提高骨肉瘤的生存率提供了可能。

    1  中药提取物的研究 

    近年来，许多学者在中药提取物诱导骨肿瘤细胞的凋亡、抑制骨肿瘤细胞增殖、诱导成骨肉瘤细胞分化等方面取得了不少成绩。

    1.1  诱导骨肿瘤细胞的凋亡  中药提取物诱导骨肿瘤细胞凋亡的研究成为重点，又以砷化物的研究较为深入。袁林[4]等利用MTT 法观察全方式维甲酸（ATRA）对MG?63细胞的生长抑制作用,结果证明，ATRA能抑制骨肉瘤细胞增殖并能引起凋亡，且呈时间和剂量依赖效应。张春林[5]用不同浓度的紫杉醇作用于骨肉瘤细胞MG?63，采用胎盼蓝染色法,光镜和显微镜观察细胞形态改变；采用原位缺口末端标记法( TUNEL)、TUN和流式细胞术(Annexin?V+FITC & PI) 对细胞凋亡进行检测。采用免疫组织化学法检测凋亡调节基因bcl?2 和bax表达。结果证明紫杉醇可以通过时间依赖性和剂量依赖性方式,促使细胞G2 / M 期阻滞和抑制细胞有丝分裂,从而诱导人骨肉瘤细胞凋亡。这种凋亡可能受到凋亡相关基因bcl?2低表达和bax高表达的调控。肖涛[6]用MTT法、透射电镜、琼脂糖凝胶电泳等方法观察AS203诱导MG63细胞凋亡的作用。证明As2O3可诱导骨肉瘤细胞凋亡，其作用机制有待进一步探讨。魏玲[7]利用MTT法观察As2O3对U20S细胞的生长抑制作用；AnnexinV?TITC+PI双参数检测细胞凋亡；流式细胞仪测定经不同浓度As2O3处理后细胞增殖细胞核抗原（PCNA）、凋亡相关蛋白Fas和bcl?2阳性细胞百分率及细胞内钙离子（IE Ca2+）含量变化。证明As2O3在体外可显著抑制人骨肉瘤细胞U20S生长并引起凋亡，其机制可能与上调Fas表达和IE Ca2+含量及降低PCNA蛋白表达有关。刘勇[8]应用噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞生长抑制率、倒置显微镜观察细胞形态、AnnexinV法检测细胞凋亡、逆转录聚合酶链反应（RT?PCR）法检测Fas、bcl?2基因的表达，观察硫化砷对骨肉瘤细胞株MG63诱导凋亡的作用。证明硫化砷可有效地诱导骨肉瘤细胞凋亡，bcl?2表达下调是诱导细胞凋亡的重要机制。

    1.2  抑制骨肿瘤细胞增殖  许多中药成分除了具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，还可以抑制骨肿瘤细胞的增殖。王利民[9]将不同浓度的苦参碱作用于培养的OS732骨肉瘤细胞，通过MTT比色法、流式细胞仪和凝胶电泳、电子显微镜技术观察检测细胞凋亡，研究分析其对骨肉瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡作用。苦参碱能显著抑制OS732细胞增殖、促进其凋亡。尹军强[10]应用MTT法，测定蟾酥水提取物对细胞株活性的影响，检测其抑制骨肉瘤细胞的时间效应和剂量效应；应用形态学观察，测定蟾酥水提取物对U20S细胞的凋亡作用，并进行细胞周期的分析。证明蟾酥水提物对骨肉瘤U20S细胞株的增殖有凋亡和抑制作用。

    有些药物在抑制骨肿瘤细胞增殖方面效果较为突出。陈永强[11]以骨肉瘤U20S细胞体外培养，采用台盘蓝排染法观察蜂毒素对细胞生长的影响，MTT法测定细胞增殖抑制率，流式细胞仪检测细胞周期和增殖细胞核抗原（PCNA）的表达。提示蜂毒素具有抑制骨肉瘤U20S细胞株生长、增殖的作用。赵晓宏[12]利用各种色波谱技术进行分离纯化升麻，根据理化性质和各种波谱技术辅以化学方法进行结构鉴定。结果表明，其中新三萜皂苷类成分有对大鼠成骨肉瘤细胞株（URM106）有明显的增殖作用的化合物。彭桂娥[13]采用掺入法观察中草药黔岭藿对大鼠成骨肉瘤细胞（UMR106）增殖的影响，结果黔岭藿能明显抑制URM106细胞的增殖，具有抑制成骨样细胞的作用。董宁征[14]应用MTT法测定一叶秋碱对人早幼粒细胞白血病细胞HL60、人红白血病细胞K562、人骨肉瘤细胞HOS?8603、人脑胶质瘤细胞SHG?44的增殖抑制作用；与环磷酰胺合用抑瘤作用相加。

    1.3  其他作用  许多中药还有诱导成骨肉瘤细胞分化，多种双向调控肿瘤细胞增殖，逆转骨肉瘤细胞系的多药耐药性等作用。王国红[15]以癌细胞诱导分化物维甲酸为平行对照，应用中药有效成分熊去氧胆酸处理人成骨肉瘤MG63细胞， 观察比较熊去氧胆酸及其与维甲酸的组合对细胞形态、细胞周期及分化的影响。结果表明，熊去氧胆酸具有与维甲酸相近似的诱导人成骨肉瘤MG63细胞分化的作用， 并且两者组合具有协同诱导成骨肉瘤MG63细胞分化的效果。陈晓超[16]通过SephacryLS200HR凝胶过滤色谱对鹿茸蛋白（PAE）进行初级分离，用MTT法检测不同分离组分对UMR106细胞增殖的影响。提示鹿茸蛋白中含有多种双向调控UMR细胞增殖的生物活性因子。王进[17]等用MTT法测定粉防己碱逆转多药耐药性的活性；用流式细胞仪检测粉防己碱对染料Rh123在细胞内积聚和外排的水平；用免疫荧光技术，定量检测逆转剂对P糖蛋白表达水平的影响。证明粉防己碱能逆转骨肉瘤细胞系的多药耐药性，其效果明显优于维拉帕米和环孢霉素A，逆转的机制在于抑制耐药系细胞膜上P糖蛋白的功能，而对其表达水平没有影响。

    2  中药制剂 

    黄涛[18]研究中药制剂艾迪注射液对骨肉瘤细胞的诱导凋亡作用及相关机制，应用免疫组化及RT?PCR方法检测不同浓度艾迪作用下骨肉瘤细胞的Fas表达，并将艾迪与顺铂单独及联合应用于骨肉瘤细胞，采用MTT法检测细胞毒性作用，流式细胞仪定量分析凋亡细胞所占比例，倒置相差显微镜、荧光显微镜及电镜下观察凋亡细胞超微结构改变。证明艾迪可通过上调Fas表达诱导骨肉瘤细胞凋亡，艾迪与亚毒性剂量顺铂合用可高效杀伤骨肉瘤细胞。龚海洋[19]通过体外培养的人成骨肉瘤细胞HOSTE85，观察福尔奔胶囊（Fullbone）对成骨细胞增殖及Ⅰ型胶原产生的影响。在体外培养的人成骨肉瘤细胞培养液中， 加入Fullbone(1?1000ug/L)，分别培养24、48、72、96小时，于结束培养前6小时，加入3H?脱氧胸腺嘧啶检测细胞增殖；或于细胞开始培养时，加入3H?脯氨酸检测Ⅰ型胶原产生。Fullbone对人成骨肉瘤细胞HOSTE85增殖具有抑制作用，对Ⅰ型胶原产生具有促进作用，这可能是其临床更年期骨质疏松的作用机制。刘晓军[20]应用流式细胞技术和West  blot技术，观察了中药固真方对大鼠成骨肉瘤细胞UMR106细胞的细胞周期及细胞周期蛋白cyclinE和cyclinA表达的影响。揭示固真方可缩短细胞周期的时程，加速细胞周期的运行，从而促进细胞增殖。李东升[21]将对数生长期的成骨肉瘤细胞加入不同浓度的化岩胶囊，发现化岩胶囊对人成骨肉瘤细胞有明显的抑制作用，且呈时间依赖性和剂量依赖性。

    3  展  望 

    中药在治疗骨肉瘤方面取得令人瞩目成绩。对于成药成方的研究要复杂得多，技术还很难做到将复杂的成药成方的有效成分量化，这给进一步研究带来不少困难。但是，研究成药成方不能离开中医的基础理论，必须从中医的病因病机入手，对骨肉瘤的分型加以研究，用中医理论系统阐述骨肉瘤的机制，用它来解释和规范成药成方的使用，为成药成方的临床研究打好基础。中药疗法具有一定的特色和优势。长期临床实践与大量实验研究证明，中医药参与防治癌瘤能适当延长带癌（瘤）病人的生存期，改善癌症患者的生存质量，减少放射治疗和化学治疗的副作用，提高患者的免疫功能。因此，进一步开发和利用中医药资源治疗骨肉瘤具有广阔的前景。

【】
  1 Coventry MB ,Dahlin DC.Osteogenic Sarcoma:A Critcal Analysis of 340 cases.Bone Joint Surg Am，1957,39:74

2 Link MP,Goorin AM,Miser AW,et al.The Effect of Adjuvant Chemotherapy on Relapse free survival in patients with Osteosarcoma of the Extremity.N Engl J Med ,1986,314:1600

3 Bacci G,Lari S.Current Trentment of High Grade Osteosarcoma of the Extremity:review.Chemother,2001,13(3):235?243

4 袁 林，郭凤颈，陈安民.全反式维甲酸对人骨肉瘤细胞凋亡的诱导作用. 华中科技大学学报（医学版）, 2007，(2)：60?62

5 张春林，曾炳芳，董 扬，等.紫杉醇对骨肉瘤细胞凋亡及对基因表达的影响.肿瘤防治研究,2007，(8)：572?275

6 肖 涛，李康华，方建珍，等.三氧化二砷诱导骨肉瘤MG?63细胞凋亡的实验研究.湖南省医科大学学报，2002,(2):23?25

7 魏 玲，王兴武，宋现让，等. As2O3对人骨肉瘤细胞的体外效应.药学杂志，2005,18:34?37

8 刘 勇，郑启新，杜靖远，等.硫化砷对骨肉瘤细胞生长和凋亡的影响.中华实验外科杂志,2005,(8):46?47

9 王利民.苦参碱诱导骨肉瘤细胞凋亡的实验研究.实用诊断与治疗杂志,2004,(5):44?47

10尹军强，沈靖南.蟾酥水提取物抗骨肉瘤作用的体外研究.中国骨肿瘤骨病,2004,(5):22?24

11 陈永逗，朱振安，戴克戎，等.蜂毒素对骨肉瘤细胞系细胞增殖的影响.上海中医大学学报，2003，(1)：21?23

12赵晓宏，陈迪华，斯建勇，等.升麻中新三萜皂苷类成分研究.中国中药杂志,2003,2:14?15

13彭桂娥，傅民魁.中草药黔岭藿对大鼠成骨肉瘤细胞（UMR106）增殖的影响.口腔正畸学,1995,(2):40?41

14董宁征，刘卫军，顾振纶.一叶秋碱对不同细胞增殖影响及鼠体内抗肿瘤作用.苏州医学院学报,1995,(3):33?35

15 王国红,田玉玲,石贺欣,等.熊去氧胆酸和维甲酸对人成骨肉瘤细胞细胞周期与分化的影响.厦门大学学报（版），2005,S(1):28?31

16陈晓超，柯李晶，陈躬瑞，等.鹿茸粗提液对大鼠成骨肉瘤细胞增殖的调节作用.中国中药杂志,2004,(1):38?41

17王 进,沈靖南.粉防已碱逆转骨肉瘤细胞系多药耐药性的研究.实用临床医学,2005,(7):12?15

18黄 涛，吕 刚，高大新，等.中药制剂艾迪联合顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡.中国骨伤,2005,(6):21?22

19龚海洋,李文仙,金 莉,等.福尔奔胶囊对人成骨肉瘤细胞HOSTE85增殖及Ⅰ型胶原产生的影响.北京中医药大学学报，2004,(1):11?12

20刘晓军，俞文华，刘德富，等.中药固真方对UMR106细胞周期蛋白表达及细胞周期的影响.中国生物化学与分子生物学报，2000,(2):264?266

21李东升，古建立，张志勇，等.化岩胶囊对成骨肉瘤细胞生长抑制作用的实验研究.四川中医，2003,(3):20?22