探讨中药复方黄芪颗粒对感染HCMV小鼠治疗作用
摘要：目的应用人巨细胞病毒-核酸扩增（HCMVPCR）反应探讨中药复方黄芪颗粒对感染HCMV小鼠作用。方法用小鼠尾静脉染毒法建立HCMV全身获得性感染模型，并用复方黄芪颗粒给小鼠灌胃治疗，然后应用HCMVPCR反应测定其内脏HCMVDNA阳性率。结果复方黄芪颗粒42.0，21.0 g/kg组HCMVDNA阳性率明显低于模型组（P＜0.05）。结论 复方黄芪颗粒对感染HCMV小鼠有一定的治疗作用。
关键词：人巨细胞病毒-核酸扩增（HCMVPCR）； 复方黄芪颗粒； 人巨细胞病毒； 人巨细胞病毒感染小鼠模型
人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus, HCMV）感染十分普遍。在妇产科，妊娠妇女孕早期原发HCMV感染可造成流产、早产、死胎、畸形，宫内生长迟缓、智力低下及损害等。目前，尚无对妊娠期HCMV活动性感染安全有效的治疗方法。本研究首次采用小鼠尾静脉染毒法建立HCMV全身获得性感染模型，并进行了复方黄芪颗粒对感染小鼠体内研究，应用HCMVPCR测定，证实黄芪颗粒组HCMVDNA阳性率明显低于模型组。现将本研究结果报道如下。
1 材料
1.1 标本收集和处理 选取60只雄性小鼠，18～22 g，共分6组，每组10只，分别为复方黄芪颗粒大、中、小剂量组，阴性对照组，模型（病毒）组和阳性对照组。均采用小鼠尾静脉注射HCMV10- 1，每只0.1 ml, 阴性对照组注射0.9%生理盐水，每只0.1 ml，于染毒第2天开始治疗。大剂量组42.0 g/kg，中剂量组21.0 g/kg，小剂量组10.5 g/kg，阴性对照组及模型（病毒）对照组均给蒸馏水，上述各组给药途径为灌胃，每天每只0.5 ml，阳性对照组（更昔洛韦），实验结束时，取主要脏器做HCMVPCR。
1.2 HCMV PCR引物按［1］，由山东省医科院生物医学研究中心合成并纯化，引物序列：上游引物为5′- GATCC GACCC ATTGT CTAAG- 3′，下游引物为5′- GGCAG CTATC GTGAC TGGGA- 3′。
2 实验方法
PCR检测标本中HCMV- DNA片段，每次扩增均设标准阳性和阴性对照。PCR体系25 μl,其中含10×PCR缓冲液2.5 μl，2.5 mmol・L- 1dNTP 21 μl,上下游混合物（各10 mmol・L- 1）1.5 μl，TaqDNA聚合酶1 μl，标本处理后取10 μl提取物，无菌蒸馏水加至25 μl，覆以30 μl无菌石蜡油。反应按94℃ 1 min，56℃ 1 min,71℃ 1 min,40个循环，最后于72℃保温10 min，扩增物经2%琼脂电泳，溴乙淀染色，紫外灯下检测荧光条带，与阳性模板同一位置即为阳性。产物长度151 bp。
3 结果
上述结果表明，黄芪颗粒组HCMV- DNA阳性率明显低于模型组，与模型组比较有明显差异（P0.05），与阴性对照组相近，小剂量组与模型组相比虽无统计学意义，但其阳性率明显低于模型组。结果见表1，图1~2。
表1 复方黄芪颗粒对感染HCMV小鼠HCMV- DNA影响组别（略）
4 讨论
诊断HCMV感染主要依靠实验室检查。利用特异抗HCMV单克隆抗体的免疫组化技术，从病毒分离培养、病变组织、脱落细胞及外周血中直接检测到HCMV抗原，提示存在活动性HCMV感染，是诊断HCMV感染可靠的依据。因受灵敏度限制，检测HCMV抗原的免疫组化技术尚难于检出微量存在的病毒抗原，不能满足临床诊断要求，提高其灵敏度亟待解决［3］。原位免疫PCR技术［2］，可用于检测微量存在的抗原，极大地提高了免疫组化检测的敏感性，我们利用其基本原理,建立了检测HCMV抗原的原位免疫PCR方法,用于诊断活动性HCMV感染。研究结果表明，本法检测HCMV感染的小鼠内脏组织细胞，可在感染后8h清晰地检出阳性信号，与常规免疫组化相比阳性信号强，阳性细胞数多，显示高敏感度。HCMV感染细胞后可在细胞核内表达即刻早期、早期和晚期蛋白，即刻早期、早期蛋白通常在病毒复制前即可产生，其存在提示病毒呈活动状态［4］。本法采用pBV220质粒DNA片段作为指示元件DNA，它是与人基因组无关的DNA片段，与HCMV- DNA序列也无同源性。在检测中平行设置的阴性对照(正常小鼠内脏组织细胞、不加抗HCMV单抗),无阳性信号出现。同时我们用本法检测了收集到的5例因感染HCMV小鼠内脏组织标本，也呈阳性染色。且黄芪颗粒组HCMV- DNA阳性率明显低于模型组，与模型组比较有明显差异（P0.05），与阴性对照组相近，小剂量组与模型组相比虽无统计学意义，但其阳性率明显低与于模型组，显示本法有较强特异性。本研究成功地将原位免疫PCR技术应用于HCMV感染小鼠模型诊断，显著提高了HCMV感染诊断敏感性，为中药复方黄芪颗粒治疗HCMV感染疗效评价提供重要的依据。
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［1］ A lain S. T ransplanation, 1997，63:1533.
［2］ 张 波，董 荷，陆哲明，等.提高免疫组织化学敏感性的原位免疫聚合酶链反应技术［J］.中华病杂志，1995,24(3):182 .
［3］ 董永绥 .继续深入进行巨细胞病毒感染的研究［J］.中华儿科杂志,1995,33(1):34.
［4］ Gaeta A, NazzariC, Angelettis,etal.Monitor ingforcy tomegalo virus infection in organ transplant recipients: analysis of pp65 antigen, DNA and latem RNA in peripheral blood leukocy les［J］.J med V irol, 1997,53(3):189.
