沙漠干热环境下猪腹部肠管火器伤后肝组织中NF?κB 、TNF?α的表达

            作者：刘江伟，吕月涛，薛会朝，李泽信，张永久，张东，雷涛

【摘要】  　　目的 探讨沙漠干热环境下猪腹部肠管火器伤后肝脏组织中核因子?κB （NF?κB）和肿瘤坏死因子?α（TNF?α）的表达及其与肝损伤的关系。方法 健康长白仔猪42头随机等分为对照组和伤后1、2、4、8、12 h 和24 h 组，在沙漠干热环境下建立腹部肠管火器伤模型后，用免疫组化及图像分析法测定各组肝脏组织内NF?κB 和TNF?α的表达，同时测定血清中ALT水平，在光镜下观察各组肝脏组织学变化。结果 伤后各组肝内NF?κB、TNF?α表达明显高于对照组(P＜0.05)，NF?κB于伤后1 h 和4 h 出现2个高峰(P＜0.05)； TNF?α于伤后1 h 和8 h 出现2个高峰 (P＜0.05)；血清ALT水平在伤后明显升高，也于伤后1 h 和8 h 出现2个高峰(P＜0.05)；伤后1、2 h 组出现逐渐加重的肝细胞水肿、变性，伤后4 h 组开始出现逐渐加重的肝细胞点状坏死、灶状坏死和炎细胞浸润，对照组光镜下未见明显的损伤性变化；NF?κB与TNF?α的表达在2 h 组和4 h 组均有正相关关系（P＜0.05）。结论 沙漠干热环境下腹部肠管火器伤后肝内NF?κB、TNF?α表达一致性升高，二者在伤后早期表达密切相关，并与肝脏结构和功能损伤变化基本一致，提示 NF?κB和TNF?α在沙漠干热环境下腹部肠管火器伤后肝损伤过程中起重要作用。

【关键词】  腹部 火器伤 肝损伤 干热环境 沙漠 核因子 κB 肿瘤坏死因子 α

　　　Abstract： Objective  To explore the expression of nuclear factor (NF)?κB and tumor necrosis factor (TNF)?α in hepatic tissue and the mechanism of liver injury following intestinal perforation due to abdominal firearm wound in dry?heat environment of desert. Methods  A total of 42 Chang?Bai piglets were equally divided into 7 groups at random: control group, and post?wounded 1?hour (h) group, 2?h group, 4?h group, 8?h group, 12?h group and 24?h group. The models of intestinal perforation due to abdominal firearm wound were established in the dry?heat environment of desert. Expression of NF?κB and TNF?α was measured with immunohistochemistry and imaging analysis in all the groups. Serum alanine aminotransferase (ALT) levels were also determined at the same time. The alteration of hepatic tissue was observed under light microscope. Results  Expression of hepatic NF?κB and TNF?α in the post-wounded groups was significantly elevated, compared to that of the control group (P<0.05); NF?κB presented two peaks in 1?h and 4?h groups; TNF?α appeared and its two peaks belonged to 2?h and 8?h groups. Levels of serum ALT were also markedly increased, and the two peaks were in 2?h and 8?h group (P<0.05). In all the measurements, the second peak exceed the first one (P<0.05). Under light microscope, hepatocellular edema and metamorphosis was gradually aggravated from 1?h group to 2?h group. Hepatocellular spot necrosis and piecemeal necrosis were observed in 4?h group, and increased from 4?h group to 24?h group. The liver morphology of the control group was normal under light microscope. Conclusion  The expression of NF?κB and TNF?α in hepatic tissue is significantly elevated in pigs with intestinal perforation due to abdominal firearm wound in dry?heat desert environment group, and is accompanied by the damage of hepatic function. The expression of NF?κB is intimately correlated with that of TNF?α in the earlier stage of injury, which suggests that NF?κB and TNF?α may play an important role in liver injury in pigs of intestinal perforation due to abdominal firearm wound in dry?heat environment of desert.

　　Key  words： abdomen; firearm wound; liver injury; dry?heat environment; desert; nuclear factor?κB; tumor necrosis factor?α

　　沙漠干热环境下腹部火器伤创伤机制的研究尚属国际研究领域的空白，腹部肠管火器伤后肝损伤机制尚待进一步研究。核因子?κB （NF?κB）是多种信号转导途径的汇聚点，通过调控炎症反应和细胞凋亡基因而在创伤、感染等多种疾病中起关键作用[1]。肿瘤坏死因子?α（TNF?α）是具有广泛生物学活性的多肽介质，介导了多种原因（如LPS等）引起的肝损伤[2]。本研究以我们已经建立的沙漠干热环境猪腹部肠管火器伤模型为基础[3～5]，动态观察伤后肝内NF?κB、TNF?α表达和肝脏形态、功能变化，探讨NF?κB、TNF?α在沙漠干热环境下腹部肠管火器伤后肝损伤机制中的作用。

　　1  材料和方法

　　1.1  实验动物分组及环境  选用解放军63650部队提供的健康长白仔猪42头，2～3月龄，体重27～33 kg，雌雄不限，随机等分为对照组和实验组（分为伤后1、2、4、8、12 h 和24 h 组）。沙漠干热环境实验场地位于新疆塔克拉玛干沙漠边缘，时间在2006年7月下旬到8月初， 实验从中午12：00开始， 实验动物在沙漠干热环境下预热 3 h 后致伤， 15 min 内转移到实验室进行观察。 沙漠干热环境平均气温（41.2±0.9）℃， 平均相对湿度（22.3±1.3）%， 辐射热强度>4.184 J/cm2·min； 实验室环境： 平均温度（23.7±0.4）℃，平均相对湿度（55.6±1.4）%。

　　1.2  腹部火器伤模型  参照[3]的方法建立腹部肠管火器伤模型。实验组于伤后相应时间点麻醉开腹，每组动物均取肝左中叶下段肝组织，10%中性甲醛固定，常规石蜡切片。对照组除不致伤外，其余步骤与致伤组相同。

　　1.3  血清肝生化测定  实验各组分别于伤后各时间点剖腹前抽取猪耳缘静脉血，对照组回实验室后立即抽血，静置30 min 后离心，东芝全自动生化分析仪(TBA?40FR)测血清中ALT水平。

　　1.4  肝脏组织病观察  石蜡切片HE染色后光镜下观察肝脏组织变化，对肝细胞变性坏死程度进行比较。

　　1.5  肝组织NF?κB、TNF?α表达检测  按NF?κB/P65及TNF?α免疫组化试剂盒（购自博士德公司）使用说明操作。用Image?pro Plus5.0医学图像分析软件检测阳性染色部位的累积光密度值，用来表示NF?κB和TNF?α表达相对量。每张切片随机选取5个不重叠的高倍镜视野分析，分析过程中所有切片的放大倍数（×400）光源强度均相同。

　　1.6  统计学方法  实验数据以x±s表示，应用 SPSS11.5行单因素方差分析Post Hoc Tests 两两比较，检验水准α=0.05。相关性采用Pearson相关分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  肝组织NF?κB表达的变化  染色阳性（黄色、棕褐色颗粒）细胞以肝细胞和库普弗细胞为主，对照组细胞质有少量阳性染色，细胞核无明显染色。枪伤后，胞浆染色增强，随伤后时间的延长胞核呈现明显的阳性染色（见封三图1）。用医学图像分析系统检测各组肝内NF?κB表达，经统计学处理，伤后各组肝内NF?κB表达均明显高于对照组，于伤后1 h 和4 h 出现2个高峰，第2个高峰值＞第1个高峰值(P＜0.05），见表1。

　　2.2  TNF?α表达的变化  染色阳性（黄色、棕黄色颗粒）细胞以肝细胞和库普弗细胞为主，并间质着色，其阳性表达强度于伤后明显增强（见封三图2）。用医学图像分析系统检测各组肝内TNF?α的表达，经统计学处理，伤后各组TNF?α的表达均明显高于对照组，并于伤后2 h 和8 h 出现2个高峰(P＜0.05)，见表1。

　　2.3  血清转氨酶的变化  伤后各组血清ALT水平均高于对照组(P＜0.05)，并于伤后2 h 和8 h 出现2个高峰值（见表1），第2个峰值大于第1个峰值  (P＜0.01)。 

　　2.4  肝脏病理形态学变化  对照组肝脏外观正常，光镜下可见肝细胞索排列整齐，肝细胞染色一致，中央静脉和血窦内皮完整。伤后1 、2 h 组出现肝窦充血并出现逐渐加重的肝细胞水肿、变性，伤后4、 8、12、24 h 组除有上述病变外，尚出现逐渐加重的肝细胞点状坏死、灶状坏死、炎症细胞浸润。

　　2.5  相关性分析  肝内NF?κB的表达在伤后2 h 组、4 h 组和TNF?α表达呈正相关，相关系数r分别为0.906、0.915 (P＜0.05)，NF?κB在伤后8h组与TNF?α呈负相关，相关系数r为-0.953 (P＜0.05)；在其他各时间点两者表达无相关性。

　　表1  肝组织NF?κB、TNF?a表达灰度和ALT（略）

　　实验组伤后各时点与对照组比较，P＜0.01，实验组伤后各时点与前一时点比较，P＜0.05

　　3  讨论
    
　　我们的研究发现，伤后各组NF?κB、TNF?α表达和ALT均明显高于对照组，NF?κB于伤后1 h 和4 h 出现2个高峰，而TNF?α的两个峰值出现较NF?κB稍晚，分别为2 h 和8 h；ALT出现峰值的时间与TNF?α相同，肝脏组织学显示在伤后4 h 开始出现逐渐加重的肝细胞点状坏死、灶状坏死、炎症细胞浸润，提示沙漠干热环境腹部肠管火器伤后，NF?κB、TNF?α的表达明显增加并呈动态变化，其变化趋势和肝脏功能受损状态一致，表明NF?κB、TNF?α可能在火器伤后介导肝脏功能损害过程中起重要作用。沙漠干热环境下腹部火器伤后由于热应激、枪伤应激、肠屏障受损以及子弹的远达效应等致使NF?κB、TNF?α迅速增加，使两者的表达分别在1 h 和2 h 时迅速达第1个高峰，从而介导了肝脏的急性损伤。第2个峰值产生的原因可能是在原来急性创伤的基础上由于肠穿孔所致腹腔感染导致了脓毒症，大量LPS经门静脉入血，LPS可直接或通过炎性因子的作用引起肝细胞的坏死[6]。并伴随NF?κB和TNF?α的表达增加，肝功能受损明显。在12 h 后NF?κB和TNF?α的表达均有所下降，提示两者的表达呈时效性，而且也可能是热应激状态下尚存在一些肝脏保护方面的因子与肝脏损害因子相互作用的结果，其机制尚待进一步研究。
    
　　许多实验证明NF?κB可以通过对多种炎性因子转录的调节而参与肝损伤的发生、，在TNF?α启动子上存在着NF?κB结合位点，NF?κB被创伤应激、内毒素等因素激活后启动促凋亡基因和TNF?α的表达，表达增多的TNF?α在介导细胞凋亡的同时再度激活NF?κB，使细胞凋亡及TNF?α等细胞因子不断增多，从而产生以NF?κB为中心的级联炎症反应[1，7]。Dajani等[8] 研究发现在TNF?α存在的情况下，NF?κB依赖的肝细胞坏死占优势，在没有TNF?α存在的情况下，NF?κB主要影响肝细胞的凋亡，因而认为诱导NF?κB和TNF?α的表达能够平衡保护（抗凋亡）和(或)损害（炎症因子）通路来决定肝细胞的命运。我们的研究经相关性分析发现，肝内NF?κB的表达在伤后2 h 组、4 h 组和TNF?α表达呈正相关(P＜0.05)，在伤后8 h 组与TNF?α呈负相关(P＜0.05)，在其他各时间点两者表达无相关性。肝内NF?κB表达高峰略早于TNF?α的2个高峰，提示在沙漠干热环境下腹部火器伤肠穿孔后NF?κB被首先激活后启动了TNF?α的高表达，两者的相互依存关系主要表现在创伤的早期。NF?κB与TNF?α在伤后8 h 呈负相关关系(P＜0.05)，可能是在级联炎症反应发生后，NF?κB的细胞内、外负反馈调节被激活，抑制了NF?κB的进一步活化所致，但总体上两者的相互作用共同介导了肝损害过程的发生、发展。
   
　　尽管沙漠干热环境腹部肠管火器伤后肝损伤的发生机制有待进一步研究，沙漠干热环境下腹部肠管火器伤后肝内NF?κB、TNF?α表达一致性升高，两者在伤后早期表达密切相关，并与肝脏结构和功能损伤变化基本一致，提示 NF?κB和TNF?α在沙漠干热环境下腹部肠管火器伤后肝损伤过程中起重要作用。
    
　　【】
  　　[1] Chen F, Castranova V, Shi X. New insights into the role of nuclear factor?κB in cell growth regulation[J].Am J Pathol,2001,159(2):387-397.

　　[2] Whiting JF, Green RM, Rosenbluth AB,et al. Tumor necrosis factor?alpha decreases hepatocyte bile salt uptake and mediates endotoxin?induced cholestasis[J].Hepatology,1995,22(4 pt 1):1273-1278.

　　[3] 刘江伟,张永久,李泽信,等.常温和干热环境下腹部肠管火器伤动物模型的建立[J].创伤外科杂志,2007,9:408-410.

　　[4] 刘江伟,李泽信,张永久,等.常温和高热环境下猪腹部火器伤后病及生存率观察[J].普通外科进展,2007,10(2):142-145.

　　[5] 刘江伟,张永久,李泽信,等.TNF?α在沙漠干热环境下猪腹部肠管火器伤后肝组织中的表达[J].临床军医杂志,2007,35(6):809-811.

　　[6] 刘江伟,张永久,李泽信,等.沙漠干热环境下猪腹部肠管火器伤后肝脏功能和形态的变化[J].现代生物医学进展,2007,7:1626-1628.

　　[7] Kumar A, Takada Y, Boriek AM,et al. Nuclear factor?κB:its role in health and disease[J].J Med,2004,827:434-448.

　　[8] Dajani R, Sanlioglu S, Zhang Y,et al. Pleiotropic functions of TNF?alpha determine distinct IKKbeta?dependent hepatocellular fates in response to LPS[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2007,292（1）:G242-252.