春和丹治疗肝纤维化大鼠的实验研究
作者：张素杰 刘金里 白建乐 赵磊 张心怡
【摘要】 目的 探讨春和丹对肝纤维化大鼠的作用。方法 将SD大鼠40只随机分为正常组、模型组、春和丹低剂量组（20 g/kg）、春和丹高剂量组（40 g/kg）及护肝片组（1.5 g/kg），每组8只。除正常组外，其余各组以四氯化碳（CCl4）皮下注射制备大鼠肝纤维化模型。除正常组和模型组外，于实验第5周开始分别给予春和丹和护肝片灌胃给药，连续5周。观察各组肝纤维化指标、肝功能指标及肝组织病理的变化。结果 春和丹可明显降低肝纤维化大鼠血清透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原（CⅣ）、层粘蛋白(LN)、丙氨酸氨基转移酶（ALT）及肝组织羟脯氨酸定量（Hyp）；明显升高血清白蛋白（Alb）；光镜观察肝组织病理明显改善(P<0.05)；春和丹低剂量组和春和丹高剂量组比较差异无统计学意义 (P＞0.05)。结论 春和丹抗肝纤维化作用确切，同时够修复肝脏炎症损伤，纠正蛋白质代谢，且不同剂量春和丹与护肝片比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
【关键词】 春和丹；肝纤维化；实验研究
Experimental study of Chunhedan on anti-hepatic fibrosis in rats
【Abstract】 Objective To explore the effects of Chunhedan（CHD） on hepatic fibrosis. Methods 40 rats were randomly divided into five groups. The rat hepatic fibrosis model was induced by CCl4. They were interfered with CHD or liver-aid tablets in CHD group and control group. The indexes of hepatic fibrosis, liver function and the proliferation degree of collagenous fiber were assayed. Results CHD decreased the level of serum HA、PCⅢ、PCⅣ、LN, ALT and Hyp in liver tissue，increased serum ALB obviously. The improvement of proliferation degree of collagenous fiber was observed by light- microscope (P<0.05). Conclusion CHD shows definite protective and therapeutic effect on experimental hepatic fibrosis in model rat.
【Key words】 CHD Mixture; Hepatic fibrosis;；Experimental study
肝纤维化是可逆性的病变，若进一步成肝硬化则难以逆转［1］。因此,抗肝纤维化是治疗肝病、防治肝硬化的重要环节。郭光业导师根据中西医理论,结合研究进展，经过长期的临床实践出经验中药复方——春和丹。本研究旨在通过动物实验，探讨春和丹抗肝纤维化的作用机理，为临床治疗提供准确的依据。
1 材料与方法
1.1 动物 健康SD大鼠（二级），雄性，体质量120～150 g，由河北省实验动物中心提供，许可证号：SCXK（冀）2003-1-003。
1.2 药物 春和丹（由柴胡10 g、黄芩10 g、制半夏10 g、甘草10 g、黄芪15 g、女贞子10 g、旱莲草10 g、丹参15 g、鳖甲30 g、穿山甲6 g、冬虫夏草3 g组成，河北省石家庄市中提供）；护肝片（阳性药，黑龙江葵花药业股份有限公司提供，批号：200412089）。
1.3 仪器 722分光光度计，上海第三分析仪器厂。
1.4 试剂 四氯化碳（CCl4），天津市河东区红岩试剂厂，批号：20040222；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、血浆总蛋白（TP）、血清白蛋白（Alb）检测试剂盒，均为南京建成生物工程研究所生产；血清透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)试剂盒，由上海海研医学生物技术有限公司生产；Ⅳ型胶原（CⅣ）、层粘蛋白(LN)试剂盒，由北京北方生物技术研究所生产。
1.5 实验方法 将大鼠随机分为5组，即正常组、模型组、春和丹低剂量（20 g生药/kg）、春和丹高剂量组（40 g生药/kg）及护肝片组（1.5 g/kg），每组8只。除正常对照组外，其余各组大鼠均首次皮下注射纯四氯化碳（CCl4）5 mL/kg，以后皮下注射40％CCl4豆油溶液3 mL/kg，2次/周，连续9周［2］。除正常组和模型组外，于实验第5周开始对春和丹高、低剂量组和护肝片3组分别进行灌胃给药，连续5周。末次给药前各组大鼠均禁食12 h，给药后2 h，分别麻醉，颈总动脉取血，分离血清检测肝功能、肝纤4项指标。
1.6 检测指标及方法 血清ALT、血浆TP和血浆AL1b用检测试剂盒测定；放免法测定血清HA、PCⅢ、CⅣ、LN含量；取左叶肝组织,10%甲醛固定,石蜡包埋,切片，HE染色观察肝脏病理组织改变；取部分肝组织匀浆后用酸水解法测量肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量。
1.7 统计学方法 统计学处理采用SPSS13.0 for Widows统计软件。数据以均数±标准差(±s）表示，计量资料采用方差分析,病评分采用Ridit分析进行统计，组间差异用双侧t检验,P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 各组动物一般情况 正常组动物一般情况良好；模型组动物饮食量减少,体毛无光泽,怕冷,活动减少,体质量增加较其他组低；春和丹高、低剂量组大鼠的情况介于正常组和模型组之间。治疗期间各组大鼠均无死亡。
2.2 各组对肝纤维化大鼠肝功能的影响 见表1。
表1 各组对肝纤维化大鼠肝功能的影响（略）
与模型组比较，*P＜0.05
表1可见，模型组ALT升高,Alb降低,与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较,春和丹高、低剂量组ALT降低,Alb升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）。
2.3 各组对肝纤维化大鼠肝纤维化指标的影响 见表2。
表2 各组对肝纤维化大鼠肝纤维化指标的影响（略）
与模型组比较，*P＜0.05
表2可见，血清HA、PCⅢ、CⅣ、LN含量以模型组最高,明显高于正常组和春和丹高、低剂量组（P＜0.05）；春和丹高、低剂量组HA、PCⅢ、CⅣ、LN含量明显低于模型组（P＜0.05）。
2.4 各组对肝纤维化大鼠肝组织Hyp含量的影响 见表3。
表3 各组对肝纤维化大鼠肝组织Hyp含量的影响（略）
与模型组比较，*P＜0.05
2.5 各组对肝纤维化大鼠肝组织病理变化的影响 见表4。
表4 各组对肝纤维化大鼠肝组织病理变化的影响（略）
表4结果经Ridit分析，正常组、春和丹低剂量组、春和丹高剂量组、护肝片组与模型组比较均有统计学意义（均P＜0.05）；春和丹低剂量组与春和丹高剂量组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；春和丹低剂量组、春和丹高剂量组与护肝片组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.6 各组肝纤维化大鼠肝脏病理组织改变 正常组：正常肝组织。模型组：肝细胞间质可见大量炎细胞浸润及大量的纤维性细胞。春和丹低剂量组：肝细胞脂性，可见少量炎细胞浸润及少量的纤维性细胞。春和丹高剂量组：肝细胞脂性，可见少量炎细胞浸润及少量的纤维性细胞。护肝片组：肝细胞脂性，可见少量炎细胞浸润及少量的纤维性细胞。见图1～5。
图1 正常组（HE染色10×20） （略）
图2 模型组（HE染色 10×20） （略）
图3 春和丹低剂量组（HE染色10×20）（略）
图4 春和丹高剂量组（HE染色10×20）（略）
图5 护肝片组（HE染色10×20）
3 讨论
近年来的研究已阐明，肝纤维化是指肝细胞发生坏死和炎症刺激时肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程,其特点是肝脏中细胞外基质(ECM)大量合成、分泌，并在肝内弥漫沉积［3］。肝星状细胞（HSC）是肝损伤时产生ECM的主要细胞，在肝纤维化的形成中起关键作用［4］。药理研究表明，一些中药具有明显的抗肝纤维化作用。春和丹是由小柴胡汤和二至丸化裁而成，小柴胡汤正是清利肝胆湿热、和解少阳枢机的经典方药。黄芪易党参，取黄芪升发肝气，以助肝之疏泄。其病机演变往往是化火伤阴。二至丸最能深入肝脏血分而滋养其阴，因此以二至丸滋养肝阴。丹参味苦微寒，归肝经，活血化瘀，疏通肝脉。丹参单体IH76423及丹酚酸是丹参的有效成分，具有良好的抗氧化作用，可明显降低大鼠肝脏Ⅰ型胶原mRNA的表达,改善肝内微循环,有良好的保肝作用［5］。丹酚酸B盐在动物模型上显示良好的抗肝纤维化作用［6］；冬虫夏草甘温，归肾、肺经，益肾保元，与黄芪配伍助肝之少阳生发之气为辅。药理实验证明，冬虫夏草能抑制肝胶原的合成代谢，促进胶原蛋白的降解［7］；穿山甲最善走窜，性专行散，能通经络而达病所，故佐以穿山甲活血通络；鳖甲咸寒，归肝经，既能滋阴养肝，与冬虫夏草配合，则阴中补阳，阳中补阴，阴阳并调，生化无穷，又能软坚散结，以增强丹参活血化瘀、疏通肝脉之力为使。诸药合用，疏肝解郁，滋养肝阴，化瘀通络，软坚散结，顺肝之生理特性，合肝纤维化病机之理。
本实验中肝组织羟脯氨酸定量是评价胶原蛋白含量和肝纤维化程度的一个重要指标［8］。HA、PCⅢ、CⅣ、LN能较好地反映肝纤维化活动的程度,对肝纤维化的诊断具有肯定的临床价值［9，10］。肝组织Hpy含量明显减少，血清肝纤维化指标HA、PCⅢ、PCⅣ、LN也明显下降，证明春合丹有较好抑制胶原蛋白合成，促进胶原蛋白降解的作用。本实验以CCl4造模，其光镜完全符合肝纤维化的病理改变，按肝纤维化实验研究方法，在形成CCl4肝纤维化大鼠模型的同时，给予春和丹治疗后，炎性细胞浸润程度明显减轻，纤维性细胞明显减少,表明春和丹具有抗肝纤维化、改善肝组织病理的作用。其机制可能是通过抑制HSC的活化,减少了肝脏细胞外基质的产生和沉积,抗肝损害作用，而起到抗肝纤维化的作用。
【】
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