肝疒徵口服液对大鼠实验性肝癌的预防作用及对肝组织细胞黏附分子-1表达的影响
【摘要】 目的 探讨肝疒徵口服液对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌的预防作用及对肝组织细胞黏附分子-1（ICAM-1）表达的影响。方法 将75只大鼠随机分为4组，正常对照组15只, 模型组、中药大剂量预防组、中药小剂量预防组各20只。除正常对照组外，给予大鼠二乙基亚硝胺（DEN）35 mg/kg，灌胃，2次/周，共16周，预防组同时给予药物预防,16周后所有实验组停用DEN，各药物预防组继续用药至20周末实验结束，于第20周末处死大鼠，分别进行：①肝组织切片常规HE染色，观察形态变化；②免疫组化方法观察ICAM-1在肝组织中的表达。结果 模型组、肝疒徵口服液大剂量预防组、小剂量预防组大鼠肝癌发生率分别为88.8%、23.08%、30.00%，预防组肝癌发生率显著低于模型组（P<0.05，P<0.01），模型组ICAM-1免疫组化染色的灰度值显著低于各药物预防组(P<0.05，P<0.01)。结论 ① 肝疒徵口服液能有效地预防大鼠实验性肝癌的发生。②肝疒徵口服液在大鼠癌变形成过程中下调肝组织中ICAM-1的表达。
【关键词】 肝肿瘤,实验性；细胞间黏附分子1；图像解释,机辅助
The effect of Ganzheng solution on the ICAM-1 expression in liver tissues of rat in the diethylnitrosamine induced hepatocarcinogenesis
【Abstract】 Objective To investigate the effect of Ganzheng peroral solution on the ICAM-1 expression in liver tissues of rat in the diethylnitrosamine induced hepatocarcinogenesis. Methods 75 male rats were randomly divided into four groups,i.e.,normal control group, model group, large dose Ganzheng solution group, small dose Ganzheng solution group , except for normal control, rats of three groups were fed with DEN water solution 35 mg/kg twice a week for 16 weeks, prophylactic drugs were used similarly. DEN was stopped to use in all groups after 16 weeks, all rats were sacrificed at 20 th experimental weeks. The histological and ultrastructural changes in liver tissues were observed by Hematoxylin-eosin (HE) staining; ICAM-1 expression in liver tissues were also used to compare the effect of the drugs mentioned above. Results 1. By the end of the 20th experimental week, the incidence of HCC was 88.8%, 23.08%, 30% in model group, large dose Ganzheng solution group and small dose Ganzheng solution group respectively. The tumor incidence of model group was significantly higher than that of other groups (P<0.05 or P<0.01). 2. Image analysis indicated that the Grey values of model group obviously decreased much more and significantly lower than those of prophylactic groups (P<0.05 or P<0.01). Conclusions 1.The results indicated that Ganzheng solution exhibited repressive effect on the genesis of HCC in rat. 2. Gan-Zhen solution can down-regulate the expressions of ICAM-1 in liver tissues during diethylnitrosamine induced hepatocarcinigenesis.
【Key words】 Hepatocarcinogenesis；Chinese herbs compound；Rat；ICAM-1
原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤，目前尚无有效的手段，近年来人们已逐渐认识到预防是控制和消灭肝癌的关键，其中中药预防因具有诸多优点而广受关注。我们对肝疒徵口服液的预防肝癌作用进行了研究，并观察肝组织细胞黏附分子-1（ICAM-1）的表达。
1 材料与方法
1.1 实验动物和材料 SD雄性大鼠［北京实验动物许可证，SPF级，京动许字（2000）第004号］75只,体质量180～200 g；空调动物室(温度17～25℃，相对湿度65%～70%)；二乙基亚硝胺（DEN）,购自Fluca公司；SP试剂盒包括封闭用山羊血清、生物素标记羊抗鼠IgG及辣根酶标记链霉卵白素，为美国ZYMED公司产品；肝疒徵口服液由黄芩、苦参、半枝莲、白花蛇舌草、三棱、莪术、黄芪等组成，河北医科大学第四制剂室经水煎、浓缩及醇沉制成。
1.2 方法 将大鼠随机分为4组，正常对照组15只, 模型组、中药大剂量预防组、中药小剂量预防组各20只。除正常对照组外，其余大鼠给予二乙基亚硝胺（DEN）35 mg/kg，灌胃，2/周，共16周，中药大剂量预防组（相当于成人用量的35倍灌胃，日1次）、中药小剂量预防组（相当于成人用量的7倍灌胃，日1次）同时给予药物预防，16周后所有实验组停用DEN，各药物预防组继续用药至20周末实验结束。于造模第20周末在大鼠肝中叶最大直径处或癌变部位取肝脏组织，10％中性甲醛溶液固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，ICAM-1免疫组化染色。
1.3 ICAM-1免疫组化染色 采用SP法。
1.4 统计学处理 应用计算机MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统测量ICAM-1免疫组化染色灰度值，研究结果数据用均数±标准差(±s)表示，采用方差分析方法、χ2检验和确切概率计算法进行统计学检验。
2 结果
2.1 一般情况 各组大鼠于DEN灌胃前平均体质量差异无统计学意义(P＞0.05)，在随后的实验中模型组大鼠体质量增长缓慢，到实验后期与其它实验组比较饮食水减少，活动迟缓，明显消瘦。实验结束时各预防组显著高于模型组(P<0.05，P<0.01)。结果见表1。
表1 各组动物体质量变化比较（略）
与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01
2.2 大体标本观察 正常对照组大鼠肝脏质地均匀，颜色红润，表明光滑。模型组大鼠肝脏体积缩小，灰白色结节弥漫分布，直径3～5 mm，大多数鼠肝触之易破碎、出血，可见大小不等的多发癌结节及出血、坏死灶，其中4只大鼠出现血性腹水。中药小剂量预防组肝脏缩小，表面可见粟粒样小结节，偶见出血、坏死灶及癌结节。中药大剂量预防组偶见坏死灶，表面结节不明显。各预防组病变程度较模型组明显减轻。
2.3 HE染色肝脏组织病理改变 模型组大鼠肝脏在重度肝硬化及胆管炎基础上可见典型的弥漫性癌结节、畸形核分裂。各预防组以肝硬化为主，仅个别可见癌结节，病理改变较模型组减轻。各组剩余大鼠镜下观察肝癌发生情况：预防组肝癌发生率显著低于模型组(P<0.05，P<0.01)，其中中药大剂量预防组肝癌发生率最低。结果见表2。
表2 各组大鼠肝癌发生率（略）
与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
2.4 各组ICAM-1免疫组化结果 见表3。
表3 各组ICAM-1免疫组化染色灰度值结果（略）
与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
免疫组化染色可见，ICAM-1在正常肝组织中不表达，在各实验组肝组织中的表达有胞浆和胞膜2种方式，2种表达方式往往并存于同一肝组织中。ICAM-1以膜表达为主时呈网状或蜂窝状排列，弥漫分布，部分血窦内皮细胞和枯否氏细胞亦有阳性表达(见图1～4)。应用图像分析系统检测各组免疫组化染色的灰度值(共分256个灰阶，最黑为0，最白为255)，模型组灰度值显著低于各药物预防组(P<0.05，P<0.01)。
图1 模型组(20周ICAM?1×100)（略）
图2 大剂量组(20周ICAM?1×400)（略）
图3 大剂量组(20周ICAM?1×300)（略）
图4 小剂量组(20周ICAM?1×100)（略）
3 讨论
中医中药肿瘤在我国有悠久的，具有独特的机制与效应，在肝癌的治疗中具有重要的地位。中药复方是根据中医理、法、方、药的理论组方并经过实践确定下来的有效方剂，是中医治疗肿瘤的主要手段之一。以往用于防治肝癌的方剂往往偏重于单一治法，疗效并不理想。肝疒徵口服液是根据中医学整体观念和辨证论治的原则，将清热解毒、祛瘀散结、健脾理气等治法有机结合起来，选用植物性中药组方，用工艺制成。本研究以DEN诱发实验性肝癌大鼠为模型，观察肝疒徵口服液对实验性肝癌大鼠肝组织ICAM-1表达的影响。DEN是强烈的化学致癌物质，广泛存在于人类的饮食物中，是目前公认的实验性肝癌的诱癌物之一，研究表明其诱发的肝癌为肝细胞癌，诱癌率高，诱癌效果稳定［1，2］，第20周，模型组肝癌发生率为88.8%，各药物预防组肝癌发生率显著低于模型组，说明本实验诱发肝癌模型是成功的，各药物预防组均有一定阻断癌变的作用，其中中药大剂量预防组效果较明显。
现代医学认为，癌症患者大多是先天免疫功能缺陷或后天因素导致体内防御机能减弱，对外来致癌因子(物理的、化学的、生物的等)抵御不力，对出现渐变的异己细胞(癌前病变或少量已形成的癌细胞)未能司其监视、排斥和歼灭功能而致肿瘤发病。中医学也认为，人体正气不足时，机体失去自我调控及抗御外邪的能力，才会导致疾病发生，故有“正气存内，邪不可干”的说法。因此，调动、增强机体的抗肿瘤免疫学机制在肿瘤的防治过程中占有重要的地位。机体的抗肿瘤免疫机制可分为细胞免疫、体液免疫，其中细胞免疫主要由T淋巴细胞、杀伤细胞(NK)和巨噬细胞介导，在抗肿瘤免疫中起主要作用。T细胞免疫应答是实质器官抗肿瘤免疫应答的决定因素［3］，有效细胞免疫应答的产生需要主要组织相容性复合体（MHC）抗原和特异性抗原肽的复合物提供第一信号，共刺激分子提供第二信号，对于可溶性抗原来说，两者均可由抗原提呈细胞（APC）提供，但对于实质器官而言，则只能由靶细胞本身来提供。ICAM-1是重要的共刺激分子之一，属免疫球蛋白（Ig）超家族成员，分布于多种细胞的表面，研究发现ICAM-1在许多肿瘤细胞中也有表达而相应正常组织表达为阴性［4，5］。国外报道应用免疫组化分析肝细胞癌细胞膜表面，ICAM-1表达率为80%～96.2%,其表现形式呈蜂窝状,但癌细胞膜表面ICAM-1的高表达并未引起有效的免疫应答，认为不能引起免疫应答的原因是癌细胞膜上的ICAM-1胞膜外结构脱落形成的可溶性ICAM-1与T细胞上的受体LAF-1结合，阻断了T细胞与靶细胞的作用。肝组织中ICAM-1的表达情况在一定程度上可反映其病理改变。在本研究中，各预防组间ICAM-1表达的差异与其病理改变情况及癌变发生相一致。从本研究可以看出，肝疒徵口服液下调肝组织中ICAM-1的表达，发挥调节机体免疫功能的作用，这是其预防肝癌的重要机制之一。肝疒徵口服液中半枝莲、白花蛇舌草清热解毒；三棱、莪术破瘀散结；黄芪健脾益气。诸药合用，扶正祛邪，标本兼治。现代药研究证实，肝疒徵口服液所用方剂中清热解毒中药主要有抗炎、细胞保护和抗癌作用；祛瘀散结中药主要有抗纤维化、改善肝脏微循环及抗癌作用；健脾益气中药主要有免疫增强作用，部分药物有肝细胞保护作用。从本研究结果看，大剂量肝疒徵口服液预防效果最佳，如何确定肝疒徵口服液的最佳预防剂量，而无明显毒副作用，是否能够通过改进与其它药物联合应用的方式、方法从而进一步提高它的防治效果，这均有待于进一步深入、全面的研究。
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