鞘内注射吗啡和PKC抑制剂对SNI模型大鼠镇痛效应的影响

　　　　　　作者：吴春生，郭曲练，王懿春，田利平，梁春齐

【摘要】  目的:观察鞘内注射吗啡和PKC抑制剂对坐骨神经分支结扎切断模型(SNI模型)大鼠的镇痛效果,探讨鞘内注射吗啡对神经病理痛大鼠的镇痛机制。方法：30只SD大鼠，随机分为6组：对照组(C组，n=5)、假手术组(N组，n=5)、生理盐水组(NS组，n=5)、吗啡组(M组，n=5)、PKC抑制剂组(P组，n=5)、吗啡和PKC抑制剂组(MP组,n=5)。每组均进行疼痛行为学观察。结果：SNI模型大鼠在术后第1天和第2天出现明显的痛觉过敏(机械性异常疼痛痛阈降低)，与术前比较差异有统计学意义(P＜0.01)。M组、P组和MP组在注药30 min后均使痛阈明显提高，与注药前比较差异有统计学意义(P＜0.01)；其中MP组的痛阈比M组和P组明显提高(P＜0.05)。结论：SNI模型可引起大鼠损伤侧肢体痛觉过敏(机械性异常疼痛)，大鼠后爪跖外侧面痛敏明显大于跖内侧面。鞘内注射吗啡和PKC抑制剂组镇痛效应明显优于单纯吗啡组。

【关键词】  神经病理痛；吗啡；脊髓背角；蛋白激酶C抑制剂

　　针对各种神经损伤性病理痛的研究已成为神经领域的研究热点之一。本研究拟应用SNI模型，观察鞘内注射吗啡和PKC抑制剂对神经病理性痛大鼠痛阈的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  盐酸吗啡注射液(10 mg/支)东北制药集团沈阳第一制药厂生产。PKC抑制剂(Chelerythrine Chloride)SIGMA公司，美国；SD健康雄性大鼠30只；聚氨基甲酸乙酯鞘内微导管(Polyurethane microspinal catheters，内径0.12 mm，外径0.35 mm)。Electronic Von FreyIITC Inc,美国。

　　1.2  方法

　　1.2.1  30只清洁级SD大鼠在适应环境2 d后，随机分为6组：对照组(C组，n=5)、假手术组(N组，n=5)、生理盐水组(NS组，n=5)、吗啡10 μg组(M组，n=5)、吗啡10 μg+ PKC抑制剂(Chelerythrine ChlorideI)11 μg组(MP组，n=5)、Chelerythrine Chloride 11 μg组(P组，n=5)。C组不做任何处理，其他5组均根据改良Yaksh法进行鞘内置管［1］。置管5天后，N组在大鼠左大腿后外侧依次分开皮肤和肌肉，暴露坐骨神经及其三个分支，然后依次逐层缝合肌肉和皮肤；其他置管的4组则建立SNI神经病理性疼痛模型［2］，制模2天后，N组和NS组用25 μl微量注射器鞘内注射20 μl生理盐水；M组和P组则分别用微量注射器鞘内注射10 μl吗啡10 μg和10 μl Chelerythrine Chloride 11 μl MP组鞘内注射10 μl吗啡10 μg+Chelerythrine Chloride 11 μg，然后用10 μl生理盐水冲管(共20 μl)。所有观察组均进行疼痛行为学观察。

　　1.2.2  大鼠行为学观察  一般行为学观察所有的SD大鼠在术前和术后均检测其体重，作为健康状况的评价。在术前及术后期间，将SD大鼠放在一个上方敞开的长方形大透明玻璃盒内，观察其行走状态及休息时的姿势。按照Kawakami［20］提出的评价方法进行评估：Ⅰ级正常运动行为，无后爪畸形；Ⅱ级正常运动行为，但明显有后爪畸形；Ⅲ级轻度运动行为异常，有垂足现象；Ⅳ4级严重运动行为异常，术侧后爪瘫痪。机械性异常疼痛每组大鼠均在实验前用Electronic Von Frey测量左后爪跖的外侧面(腓肠神经区域)和内侧面(隐神经区域)的机械性刺激痛阈，SNI术前第1天和第3天测定作为基础值，术后每天均测定机械性异常疼痛痛阈，测定时间均为上午8点到10点。N组、NS组、M组、MP组和P组则均在注药后测定机械性异常疼痛痛阈。测量方法：将大鼠放在一个有透明有机玻璃盒罩的金属框架上，盒的底面为有孔的金属网格，用Von Frey 单纤丝一连串的上行力量刺激大鼠后爪的跖表面(外侧面和内侧面)，上行力量为由轻逐渐增强，直致后爪出现一个敏锐的回缩，然后记录下显示屏显示的数字作为机械性刺激痛阈，连续测量3次，每次间隔5 min～10 min，取其平均值作统计学分析。

　　1.2.3  数据处理及统计学分析  计量资料用均数±标准差(±s)表示，数据分析采用SPSS 11.0统计软件进行数据处理，统计学方法采用单因素方差分析(One?way Analysis of Variance，ANOVA)，两组间比较采用SNK?q检验(Student?Newman?Keula，S?N?K法)，P＜0.05认为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  各组大鼠体重比较  术前各组之间大鼠体重无明显差异，手术后各组大鼠体重也正常增长，相比较无统计学差异(P＞0.05)。

　　2.2  各组大鼠行为学观察结果  所有实验大鼠术前均步态正常，足趾伸展，运动及承重均无异常；SNI术后动物表现为：手术侧后爪不堪负重，出现术侧足外翻畸形，后爪内侧着地的姿势改变，除有3只大鼠的活动评级达到3级外其余大鼠评级都在2级；在实验观察过程中，动物在休息或活动过程患侧后爪偶然接触笼面，会发生明显的缩足反应，大部分的大鼠(4/21)可在无任何刺激的情况下发生自发性的缩足发射；整个观察期间无动物自残现象。胫神经和腓总神经结扎切断后，SNI模型大鼠后爪跖外侧面(腓肠神经区域)和内侧面(隐神经区域)的Von Frey机械性刺激出现明显的痛敏现象(痛阈下降)；SNI操作后第1天、2天，NS组、M组、MP组和P组与术前基础值比较痛阈明显下降，相比较差异有统计学意义(P＜0.01)；其中大鼠后爪跖外侧面(腓肠神经区域)相对于内侧面(隐神经区域)刺激的痛阈下降更明显(P＜0.01)。NS组在注药后30 min与注药前相比差异无统计学意义(P＞0.05)；M组、MP组和P组在注药后30 min与注药前相比差异有统计学意义(P＜0.01)，其中MP组的痛阈比M组和P组明显提高(P＜0.05)，而C和N组则在这些检测时段变化无统计学意义，具体见表1。

　　表1  各时间段大鼠左后爪跖外侧面的Von Frey机械性刺激痛阈(g,±s)变量（略）

　　注：*与术前比较P＜0.01，#与同时间点NS组和MP组比较P＜0.05，△与同时间点的NS组、M组、P组比较P＜0.05。

　　表2  各时间段大鼠左后爪跖内侧面的Von Frey机械性刺激痛阈(g,±s)变量（略）

　　注：*与术前比较P＜0.01，#与同时间点NS组和MP组比较P＜0.05，△与同时间点的NS组。

　　3  讨论

　　神经病理性疼痛是与多种周围神经障碍相关联的一组共同表现的症状。通常外周神经损伤引起的神经病理性疼痛表现为痛觉过敏、异常痛敏、感觉缺失和自发性疼痛［3］。在临床上神经病理性疼痛是常困扰患者的一种病症，为了能了解其发生的病理机制以及为其提供一个平台，所以有许多学者制作一些动物模型来模拟临床上神经病理性疼痛的症状。神经病理性疼痛经典的外周神经损伤模型主要为：慢性缩窄性损伤模型［4］(CCI模型)，部分坐骨神经结扎模型［5］(PSL模型)和脊神经结扎［6］(在L5和L6脊神经结扎)模型(SNL模型)。但是这些模型也具有不能区分混合的轴突和混合的DRG；与人的实际神经病理性痛的症状有些不符合；并且具有操作复杂，变异性性大，容易感染等缺点。由Woolf等［5］于2000年建立的SNI模型就克服了以上的缺点。这种模型采用结扎并切断坐骨神经的两个分支腓总神经和胫神经，而保留完整的腓肠神经，这样就可以使损伤的神经同未损伤的神经分离而损伤的神经胞体和未损伤的神经胞体的混合，能较好的模拟外周神经损伤引起的神经痛。由于SNI模型对机械性异常痛敏表现显著，所以本研究采用大鼠SNI模型并用Von frey机械性刺激来测定模型的痛觉过敏。鞘内注射吗啡是经典的神经病理痛镇痛药物,鞘内注射PKC 抑制剂是近年来在动物疼痛实验中研究较多的新型干预试剂N动物实验显示PKC抑制剂与吗啡合用有协同镇痛作用，是否可减少吗啡用量有待进一步研究。如果合用能减少吗啡用量，从而减少吗啡的副作用和耐受性，那么在临床上有广阔的应用前景。

【】
  　　［1］ Zhallg L，Hof AO，Wimalawansa SJ，et al.NArthritic calcitonin/alpha ealcitonin gene?related peptide knockout mice have reduced nociceptive hypersensitivity.Pain，2001，89：265?273.

　　［2］ Chatta S, Nimmagadda D. Calcitonin gene?related peptide: understanding its role.Indian J Pharmacol,2004,36:277?283.

　　［3］ 房春燕，李宁，高尔.降钙素基因相关肽在痛觉调制过程中作用的研究进展［J］.康复医学杂志，2004，19：554?556.

　　［4］ Fraser NJ，Wise A，Brown J，et al.NThe amino terminus of receptor activity modifying proteins is a critical determinant of glycosylation state and ligand binding of ealeitonin receptor?like receptor.Mol Parmacol，1999，55：1054.

　　［5］ Huang YH，Brodda?Jansen G，Lundeberg T，et al.Anti?nociceptive effects of calcitonin gene?related peptide in nucleus raphe magnus of rats：an effect attenuated by naloxone.Brain Res，2000，873：54.

　　［6］ McLatchie LM，Fraser NJ，Main MJ，et al.RAMPs regulate the transport and ligand specificity of the calcitonin?receptor?like receptorNNature，1998，393(6683)：333.