肾穿刺标本的常规染色制作程序探讨
【关键词】 肾穿刺活体标本；制作；程序
［摘要］ 目的：探讨肾穿刺标本制作技术特点，制订一套较快而稳定的制作程序。方法：对本科室5千多例肾穿活检病例制作的技术和步骤进行比较和。结果：本科室5千多例肾穿刺活检标本的冰冻切片，HE切片，PAS，PASM,Masson三色以及刚果红和甲基紫等特殊染色都完全满足病理诊断。结论：本科采用的肾穿刺活体标本制作程序稳定而且较快。
［关键词］ 肾穿刺活体标本；制作；程序
The Investigation of Routine Staining Procedure for Renal Biopsy
LAI Yingrong，TAO Yu,LIANG Yingjie
(SUN YATSEN University the First Affiliated Hospital,Guangdong 510080,China)
Abstract：Objective To explore the technique skill of making specimens of kidney Biopsy via paracentesis and to create a set of stable and fast procedure.Methods The technique skill and procedures that we use to make more than five thousand kidney Biopsy specimens via paracentesis in our laboratory were compared and analyzed.Results All the specimens we made completely have accordance with the pathological diagnosis,including frozen section,HE section,and the specific stain such as PAS,PASM,Masson,Congo red and methyl violet.Conclusion The procedures we use to make kidney paracentesis specimens are stale and fast.
Key words：Kidney Biopsy via paracentesis；Technique skill；Procedure
肾小球病是一种发病率较高疾病，肾穿刺活体检查是确诊肾病的重要手段［1］，因此各大纷纷开展肾穿刺活体检查项目。肾穿刺活检的标本主要来源于肾移植、肾病两种，这两种情况活检标本都相对较小，要做的检查相对较多，因而需将标本分成三份：常规HE及特殊染色；冰冻切片；电镜检查等，许多医院肾穿刺活体标本制作技术缓慢，虽然临床开展了肾穿刺活检和肾移植手术，但肾活检的标本制作仍未能满足临床病理诊断需要，影响其医院对肾病活检工作发展。我们对19年来肾穿活体制作技术和方法进行对比和总结，得出一套稳定而较快的肾穿刺活体标本制作的程序和方法，同时对各要点进行说明。使肾穿刺活检制作者获得一套较为标准的操作方法。
1 材料和方法
1.1 中山大学附属医院及省内各大医院送来的肾新鲜标本5千多例，冰冻机是LICAl800，山顿、婴花，石蜡切片机为LICA2000R，脱水机为山顿全封闭脱水机，将新鲜的肾穿刺标本在放大镜下观察，确定是否有肾小球，然后将有肾小球的标本分成三份，一份作冰冻切片(最好有肾小球1个~4个)，二份作电镜检查(1个~2个肾小球)2％戊二醛固定，余下作常HE及特殊染色。冰冻切片一般切片7张~8张，厚度为4 μm~5 μm，作IgG、IgA、IgM、C3、Glq、Fg抗体检查，石蜡包埋切片2 μm~3 μm，分别作常规HE染色，PAS，MassonPASm以及刚果红和甲基紫等特殊染色。
1．2 六胺银法(PASM)
1.2.1 Gomori六胺银染色法溶液配制
六胺银贮备液：5％硝酸银水溶液5 ml+3％六次甲基四胺100 ml,配好4 ℃冰箱备用；5％四硼酸钠水溶液；六胺银工作液：六胺银贮备液10 ml+双氧水20%+5％四硼酸钠水溶液2 ml。
1.2.2 PASm染色步骤
切片脱蜡至水；0．5％高碘酸氧化30 min，水洗；10％铬酸氧化20 min，或2％硫酸铁铵水溶液用微波加温(低挡)2 min，水洗，1％偏重亚硫酸钠水溶液处理30 s，水洗，蒸馏水洗；放入六胺银工作液20 min~30 min 65 ℃水浴箱中或用微波加温(低挡)4 min，取出切片，蒸馏水洗，镜检以肾小球毛细血管基底膜出现黑色的沉淀为标准；0．1％氯化金水溶液调色30 s；流水冲洗10 min；Maery氏苏木素5 min；流水冲洗5 min；0．5％伊红染3 min；常规脱水透明封片。结果：肾小球囊基底膜和肾毛细血管球基底膜，弹力纤维及一些网状纤维是黑色，细胞核蓝褐色，细胞浆浅红色。
1．3 Masson三色法
1.3.1 试剂配制
丽春红酸性品红液：丽春红0．7 g+酸性品红0．3 g+蒸馏水99 ml+冰醋酸1 ml；1％磷钼酸水溶液：磷酸1 g+蒸馏水加至100 ml；2％苯胺蓝液：苯胺蓝2 g冰醋酸2 ml+蒸馏水100 ml。
1.3.2 操作方法
切片脱蜡至水；Bouin氏液补充固定微波低挡2 min或60℃水浴1 h；流水稍洗；天青石蓝染液3 min；Mayer氏苏木素5 min；水稍洗；2％盐酸酒精分化；水冲洗数分钟；春红酸性品红液染5 min~10 min；蒸馏水稍冲洗；磷钼酸水溶液处理约5 min；直接用苯胺蓝液或亮绿液复染5 min；1％冰醋酸1 min；95％酒精稍冲洗，常规脱水透明封片。结果：胶原纤维呈蓝色(用苯胺蓝液复染)或绿色(用亮绿复染)。胞质、肌纤维和红细胞，免疫复合物红色，细胞核蓝褐色。
1．4 高碘酸―无色品红法(PAS)
1.4.1 试剂配制
0．5％高碘酸水溶液：高碘酸0．5 g+蒸馏水加至100 ml；0．5％偏重亚硫酸钠液：偏重亚硫酸钠0．5 g+蒸馏水100 ml；无色品红液(Schitf氏试剂)：碱性品红1 g+蒸馏水200 ml+1 N 盐酸20 ml+偏重亚硫酸钠1．5 g+活性碳1．5 g。
1.4.2 操作方法
切片脱蜡至水；0．5％高碘酸氧化5 min~8 min；流水冲洗2 min，再用蒸馏水洗；入无色品红液于暗处并加盖作用10 min~20 min；0.5％偏重亚硫酸钠液滴洗2次，每次约1 min；流水冲洗5 min；Mayer氏苏木素1 min；稍水洗；常规脱水透明，中性树胶封固。结果：肾小球囊基底膜，肾小管基底膜和肾毛细血管球基底膜均呈红色，淀粉染色方法与步骤略。
2 结果
96％左右的肾穿刺标本都能确保冰冻、HE、电镜标本都有肾小球。按上述程序操作的PAS,Masson，PASM染色对比鲜艳，效果好，完全满足病理诊断。
3 讨论
3．1 配制Schiff氏液时
注意配制时所用的容器洁净，冷却温度，IN盐酸浓度要准确，偏重亚硫酸钠纯度要好(即要有较浓的刺激性气味)。否则，配出的Schiff氏液效果不好，染色力差［2］。如果有条件的，可以购买进口配好的Schiff氏液，效果亦很好。Schiff氏液，六胺银贮备液，0．5％高碘酸，1％偏重亚硫酸钠水溶液要放在4 ℃冰箱保存。
3．2 Masson染色
它要求组织用Bouin氏液固定，有些一开始就用Bouin氏液固定组织，我们发现这样虽对Masson染色效果好，但经Bouin氏液固定的肾穿标本切片时组织较硬，不利于切片，同时不利于做其他特殊染色如PAS，刚果红和甲基紫等。因而我们认为用10％中性甲醛固定肾穿活体标本较好，易于作其他染色，Masson染色时，只要将切片脱蜡至水，蒸馏水洗后放入Bouin氏液补充固定，用微波低挡2 min即可，但要注意在微波炉内放一杯自来水，防止Bouin氏液沸腾，这样可以大大减少Masson染色时间，而且效果很好。
3．3 PASM染色时
如果用铬酸氧化时，基底膜相对清晰，但浸银时间稍长，用铬酸氧化时一般不能用微波加温，因为铬酸容易挥发，用微波加温操作时间上难掌握。用2％硫酸铁铵水溶液代替铬酸，可用微波加温操作，浸银时间短［3］，但基底膜着色深，粗大。同时加染HE染色，便于医生在一张片观看银着色及HE的情况。
3．4 标本取材
最好在B超穿出后立即进行分取，因为标本越新鲜，在放大镜下观察肾小球越明显，肾小球在组织内见小红点，冰冻标本要用OCT包埋后放入冷冻箱内，如液氮瓶或低温冰冻机内。常规标本及电镜标本要立即固定，因为标本离体后，即使入冰壶，但因组织小，很快干涸，而放入湿纱布后，由于组织吸水而变白，在分标本时，肾小球观看有困难而影响取材。在作特殊染色时基底膜崩解而变粗及模糊不清。HE染色观察到有自溶解现象。冰冻切片余下的标本要放回常规固定标本内，同时做常规切片染色。以确保常规HE切片有肾小球。
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［1］陶瑜，赖英荣，吴惠群，等.IgA肾病的病理特点及类型［J］.医学版.中山大学学报，2002，(38)：6365.
［2］凌启波.实用病理特殊染色和组化技术［M］．广州：广东高等出版社，1989：4850.
［3］张威，梁英杰，赖英荣.自控微波技术在肾穿刺活检六胺银染色中的应用［J］．中山医科大学学报，2002，23(58)：143144.
