成人脂肪来源干细胞定向诱导分化为软骨细胞的实验研究
作者：梁笃, 樊粤光, 王海彬 鲁峰
【摘要】 【目的】诱导脂肪组织来源干细胞(ADSCs)定向分化为软骨细胞并进行鉴定，为软骨组织工程获取大量种子细胞做准备。【方法】对患者抽脂术的脂质部分进行分离培养及传代，采用四氮唑复合物(MTT)法测定细胞活性并描绘细胞增殖曲线，通过流式细胞仪将培养的细胞行干细胞鉴定，将第4代的ADSCs向软骨细胞定向诱导分化并行阿新蓝染色鉴定;免疫组化检测成软骨方向诱导后的ADSCsⅡ型胶原的表达。【结果】ADSCs体外增殖速度快，并且保持稳定的倍增率直至13～15代;流式细胞仪分析提示该细胞具有干细胞特性;通过定向分化技术，ADSCs可向软骨细胞分化，阿新蓝染色及Ⅱ型胶原表达均呈阳性，说明定向分化后的细胞具备正常软骨细胞的功能。【结论】成功诱导ADSCs向软骨细胞定向分化，为软骨组织工程提供了可靠的种子细胞。
【关键词】 脂肪组织来源干细胞;软骨细胞/病;组织工程;细胞培养
软骨细胞来源不足一直是制约软骨组织工程应用的重大难题，由于软骨细胞取材复杂，而且难以一次获得足够的细胞数量以满足组织工程的需要，因此探索软骨细胞的其他来源具有重要的意义。干细胞为具有多向分化潜力的细胞，对干细胞进行定向诱导可分化为软骨细胞。脂肪来源干细胞(ADSCs)具有一般干细胞的特点，而且比其他细胞有以下优势：(1)获取容易;(2)体外增殖速度快，且不必进行永生化就能获得足够的细胞用于移植;(3)ADSCs能够进行自体移植，无免疫排斥反应等[1-6]。脂肪干细胞所具有的修复、替代和再生能力为临床医学提供了一个新疗法的机会。本研究对成人ADSCs进行了定向诱导分化，现报道如下。
1材料与方法
1?1组织来源脂肪组织来自于南方医科大学附属南方整形外科住院病人腹部及大腿脂肪抽脂术获得的脂质部分,供体无传染病及内分泌疾病,男女不限 ,抽取前均获得供体本人同意，并承诺只用于试验研究，平均脂肪抽吸物100 mL。
1?2主要试剂和仪器DMEM培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清(FBS)均由美国Gibco 公司提供;Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、转化生长因子(TGF)、四氮唑复合物(MTT)、硫酸酚嗪甲酯(PMS)、 吲哚镁辛、胰岛素、二甲基亚砜(DMSO)、 地塞米松均由美国Sigma 公司提供;鼠抗人CD29、CD34、 CD44、CD106、CD133、HLA?DR 单克隆抗体均由美国Zymed公司提供;CO2 培养箱(德国SHELLAB公司);离心机(德国Heraus公司);倒置显微镜(日本Nikon公司);酶标仪(日本Rader公司); BH光学显微镜、显微照相系统(日本Olympus公司);SW?CJ?1F型超净工作台(苏州净化设备厂);80?2型离心机(上海手术器械厂);DHW?600不锈钢电热恒温水浴箱(余姚长江温度仪表厂)。
1?3人脂肪组织来源干细胞(ADSCs)的分离和培养[7]取人吸脂术中吸出的脂质部分，于超净工作台内用PBS缓冲液清洗组织并切除肉眼可见的小血管。将组织充分剪碎，1 g/LⅠ型胶原酶 ，37℃消化 40 min， 等容积DMEM+10%FBS 中和酶活性， 200 μm 筛网过滤，1 300 r/min 离心 5 min，DMEM+10%FBS重悬后，细胞悬液用细胞记数板记数，按1×104~2×104接种于25 cm2培养瓶中，培养瓶中加入完全培养基, 置入37 ℃、体积分数为5% 的CO2孵箱中培养,48 h换液后每3~4 d换液1次。原代细胞培养7～10 d即可融合传代。
1?4细胞传代弃去原培养液，PBS洗涤1次，以去除血清，加入适量2?5 g/L胰蛋白酶+0?38 g/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(覆盖瓶底即可)进行消化，于室温下消化约1 min，在倒置显微镜下观察见胞质回缩、细胞间隙增大，立即吸出消化液，加入适量基础培养基终止消化，用吸管反复轻柔吹打，将细胞吹打下来，800 r/min离心5 min，以含体积分数10%胎牛血清，10 g/L青、链霉素原液的高糖DMEM培养基重悬沉积细胞，按1∶2的比例进行传代。当传代细胞生长接近单层汇合80%时，可继续传代。
1?5MTT 法测定细胞活性并描绘细胞增殖曲线[8]收集第3代ADSCs，接种于 96 孔板，每孔2×103个细胞，加完全培养基200 μL,设每组4个复孔。置37℃、体积分数为5% CO2孵箱培养8 d，每天取1组细胞，吸弃上清, 每孔加入50 μL MTT-PMS工作液 (1?485 mmol/L MTT、5 mmol/L PMS,混合比例为200∶1),继续培养4 h。振荡5 min,以主波长450 nm,参比波长630 nm在酶标仪上比色,测定吸光度D值，取其均值，以时间为横轴，D值为纵轴绘制出ADSCs生长曲线，并细胞倍增时间。
1?6干细胞标记鉴定取培养扩增后第4代的ADSCs，去掉培养液，用1∶1的2?5 g/L的胰蛋白酶和0?2 g/L EDTA混合消化，用含10 g/L牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗涤后制成含有1?5×106个ADSCs的单细胞悬液，等分为7份，分别加入7个Eppendorf管中，一号管加入20 μL对照试剂，其他试管分别加入CD29、CD34、CD44、CD106、CD133、HLA?DR单克隆抗体各20 μL，每管分别加入细胞悬液100 μL(1×106个细胞)，室温孵育25 min，用含1%BSA的PBS洗涤后，流式细胞仪检测。
1?7成软骨分化及阿新蓝染色定性选择第4代的ADSCs进行体外成软骨定向诱导分化。10 ng/mL TGF、10 mmol/mL 地塞米松、50 mg/mL维生素C、高糖DMEM配制成软骨细胞诱导液。以 2×104/cm2 细胞密度接种于21孔板，细胞接种12 h 后加入诱导液，每3d换液1次，诱导11 d;空白对照组为第3代细胞接种后在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中常规培养。倒置显微镜下观察细胞形态。诱导培养时培养孔内预先放置盖玻片，使细胞贴盖玻片生长，至11 d时取出细胞爬片，阿新蓝染色观察细胞糖胺聚糖分泌情况。倒掉诱导培养ADSCs培养皿中的诱导液， 体积分数10%甲醛固定1 h，PBS冲洗15 min，蒸馏水冲洗1次，滴加10 g/L阿新蓝染色，染色3 h，加入体积分数95%乙醇，洗去多余的染液，烘干，中性树胶封片。
1?8免疫组化法检测成软骨诱导后ADSCs Ⅱ型胶原表达空白对照孔和诱导孔分别于培养和诱导的7、11、21 d取出盖玻片，10 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗5 min，共3次;体积分数3% H2O2消化内源性过氧化物10 min，PBS冲洗5 min，共3次;加入含5 g/L羊血清白蛋白稀释的1∶200鼠抗人Ⅱ型胶原单克隆抗体;10 min后PBS冲洗5 min，甩掉余液，加入一抗(华美公司)，置湿盒1 ℃过夜;37 ℃ 复温1 h，PBS洗2次，每次5 min，滴加异硫氰酸荧光素(FITC)连接二抗(1∶200)华美公司，37 ℃孵育30 min;PBS冲洗5 min，共3次。3，3’-二氨基联苯胺(DAB)显色3 min，系列酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，以不加一抗样本作为空白对照。
1?9统计学方法数据采用SPSS 11?0软件包进行统计分析。
2结果
2?1倒置显微镜观察接种后 21 h 细胞贴壁，少量悬浮不贴壁的细胞可随换液逐步清除掉。倒置显微镜下见细胞逐步贴壁、伸展。呈短梭形、多角形、细长纤维形，形态类似成纤维细胞。培养 18 h后首次换液，即可见大量的ADSCs已经充分伸展呈长梭形;72 h 后开始聚集呈团簇状生长，形成细胞集落，数量明显增多并相互连接成片，可以进行传代，结果见图1(彩图页第428页)。单层细胞以 5 g/L胰蛋白酶消化传代，以后每1～3 d传代1次。本实验传至15代，细胞形态及倍增时间无明显改变。
2?2MTT法测定细胞活性并描绘细胞增殖曲线细胞生长曲线近似倒“S”形，在接种的前3 d细胞处于滞留期，而后进入对数生长期，约在第 6天达最高峰(图 2)。经，细胞倍增时间约50 h。
图2ADSCs生长曲线图
Figure 2Growth curve of ADSCs2009年第26卷广州中医药大学学报2?3细胞表面抗原分析结果见图3。流式细胞仪分析第4代ADSCs细胞表型：CD29+(77?5%)，CD34-(3?3%)，CD44+(26?8%)，CD106-(3?8%)，CD133-(3?1%)，HLA?DR-(2?0%)，表明该细胞具有干细胞特性。HLA?DR表达不明显，排除该类细胞是成纤维细胞。
2?4成软骨诱导细胞阿新蓝染色结果见图4
图3ADSCs细胞表面抗原分析
Figure 3Analysis of ADSCs surface antigen
(彩图页第428页)。接种的细胞最初呈圆形，21 h内可见体积较大的单个核细胞贴壁，诱导培养后，细胞形态逐渐由梭型向多角形、多边形转变。诱导10 d后多数细胞呈密集生长，有典型结节生成，阿新蓝染色结果呈阳性反应(图4-a)，空白对照组无改变(图4-b)。
2?5Ⅱ型胶原表达的免疫组化结果结果见图5(彩图页第428页)。成软骨诱导7 d后，细胞的Ⅱ型胶原免疫组化为阳性，可见棕黄色的颗粒分布于细胞胞浆内(图5-a)。空白对照组均为阴性(图5-b)。
3讨论
2001年Zuk等[9]以外科切除或吸脂方式获得的人或大鼠脂肪组织为研究对象，利用胶原酶消化的方法从处理后的脂肪中分离出了一种成纤维样的细胞。体外培养过程中发现该细胞群具有稳定的倍增效应和低衰老性，且能够向多种细胞类型分化，与干细胞所特有的多向分化潜能及自我复制能力等基本特征一致。该细胞群可从脂肪组织抽吸物中大量分离获取。目前，各国研究人员大多采用这种方法来分离和培养此种细胞并将所得的细胞称之为脂肪来源的干细胞(adipose?derived stem cells, ADSCs)。
目前尚无直接方法可鉴定脂肪干细胞。常用的鉴定方法都是通过在培养过程中出现分化表型和多向分化能力，然后逆推得知是否为干细胞。根据脂肪干细胞的概念，应该符合：(1)来自脂肪组织，形态为梭形，胞浆内无脂肪颗粒;(2)增殖迅速，与来自同一个体的成纤维细胞在倍增时间上接近;(3)具有多向诱导分化潜力,细胞表面有干细胞标志性抗体。
本研究还发现，ADSCs不像骨髓间充质干细胞(MSC)对培养基中胎牛血清的来源和质量有严格要求，在加有多种批号胎牛血清的DMEM培养基中均能很好地扩增。在传代培养中，平均倍增时间为50 h，并且保持稳定的倍增率直至13～15代，其中衰老和死亡细胞所占比例也很少，与报道的结果一致[6，10]，这表明ADSCs体外扩增能力很强，传代培养易于获得大量有分化能力的细胞。脂肪干细胞可以从简单的抽脂法获得，而且供应充足，能反复取材，损伤较小，也不会引起道德争论[1]。
ADSCs公认无特异性的表面标志，目前用于鉴定MSC的表面标志主要有：CD14、CD29、CD34、CD38、CD44、CD45、CD59、CD105、CD116、CD167等。研究证实多种干细胞皆可表达CD29、CD34、CD44，具代表性的表面标志为CD44，本实验采用流式细胞术测定实验组细胞CD29、CD44两种干细胞表面标志，表达均呈阳性，说明其具干细胞特性。
有研究表明[6，10-13]，软骨细胞与骨髓基质来源干细胞的混合培养后能促进ADSCs的成软骨分化，同时还能有效地抑制软骨细胞体外培养的去分化。因此，我们设想将软骨细胞与ADSCs混合培养后，发挥两种细胞的协同作用，可能起到效应叠加的作用，有可能出现1+1>2的效果。因此，下阶段的研究可以围绕软骨细胞与ADSCs混合培养后的协同效应展开。
总之，ADSCs被证实能在软骨细胞培养环境下定向分化为成熟软骨细胞，并分泌大量的功能性Ⅱ型胶原，这为软骨细胞的来源提供了一种新的思路。在特定的环境下，可诱导ADSCs向软骨细胞定向分化。以向软骨方向分化后的ADSCs作为软骨组织工程的种子细胞，可能具有比单纯的软骨细胞更好的效果，可为软骨组织工程提供可靠的种子细胞。
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