甲氧西林耐药溶血性葡萄球菌的基因多态性研究
【摘要】 目的 应用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术，对甲氧西林耐药溶血性葡萄球菌（MRSH）进行基因多态性研究。方法 对81株MRSH通过RAPD技术进行扩增，电泳条带采用SPSS 13.0软件分析，根据树状图分型。结果 81株MRSH通过RAPD技术可产生相对固定的6条电泳带，经遗传相关系数分析后可分为8型，其中A型占70.37%，而10株血培养阳性的MRSH中有9株为A型。 结论 通过RAPD分型研究，可以了解MRSH基因流行型的特性，为该菌的感染控制提供分子流行病学依据。
【关键词】 甲氧西林耐药性 随机扩增多态DNA技术 葡萄球菌属
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ To investigate the polymorphism of the methicillin resistant staphylococci haemolyticus （MRSH）by Random Amplified Polymorphic DNA （RAPD） Technique. Methods Eighty one MRSH isolates were collected. The gene of MRSH were amplified by RAPD, the bands were analyzed by SPSS software, the dendrogram were used for cluster analysis. Results There were 6 stable bands produced by RAPD, according to which the 81 MRSH were classified into 8 genetypes. The A type got 70.37% of all isolates，and 9 of 10 MRSH which were isolated form blood were belong to A type. Conclusions RAPD asssy reveals the special epidemic genotypes of MRSH in hospital, which provides molecular epidemiological evidence for strategies to control MRSH infection.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ methicillin resistance; random amplified polymorphic DNA technique; staphylococcus
凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase-negative staphylococci, CoNS）长期以来被认为是定植于皮肤黏膜对人体无害的共栖菌[1]，但是随着各种移植物的广泛使用和其他侵袭性操作的增加，CoNS已经成为感染的重要病原菌[2]。溶血性葡萄球菌的临床分离率在CoNS中仅次于表皮葡萄球菌。而甲氧西林耐药溶血性葡萄球菌（Methicillin resistant sta-phylococci haemolyticus，MRSH）的多重耐药情况则是CoNS中最严重的。多重耐药的MRSH的流行，如果得不到及时的控制，其致死率高达18.8％～57.0％[3]。因此早期发现MRSH感染的流行非常重要。
随机扩增多态性DNA（Random Amplified Poly-morphic DNA，RAPD）技术又称随机引物PCR，是一种广泛使用的分子流行病学技术，具有快速、操作简便等特点。已经被用于许多病原菌的分子流行病学研究。本次研究采用RAPD技术对临床分离的MRSH作同源性分析，为控制MRSH感染流行提供基础。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集2002年4月至2003年4月浙江大学医学院附属第一医院临床分离的溶血性葡萄球菌81株。所有菌株均经生物梅里埃公司API鉴定板重新鉴定，并重新测定MIC证实为MRSH[4，5]。81株菌株主要由移植病房、普外科病房、ICU等病房采集，其中移植病房分离株31株，ICU病房分离株27株，血培养阳性10株，痰培养阳性26株，引流液、腹水培养阳性45株。
1.2 试剂和仪器 药敏板、LB培养基等购自杭州天和微生物试剂有限公司；DNA纯化试剂盒Genomic DNA Purification Kit、Taq酶等（由上海申能博彩生物科技有限公司生产）；RAPD引物：ERIC1R 5`-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3`（由上海申工合成）；凝胶成像仪（由天津市器材公司生产BIO-RAD, 美国）；PCR仪（由西安赛亚科技有限公司生产Hybaid, 美国）。
1.3 方法
1.3.1 RAPD模板制备：细菌接种于2ml LB培养基中，35℃振荡过夜，稀释至4个麦氏单位，采用Genomic DNA Purification Kit抽提染色体DNA作为模板，-20℃保存备用。
1.3.2 反应体系及反应参数：采用25μl反应体系，反应混合物通过PCR仪扩增。反应参数：94℃预变性5 min，然后94℃ 45s，34.1℃ 1 min，72℃ 2 min，循环40次，最后72℃延伸5 min。PCR产物于1.0％凝胶电泳，0.5×TBE电泳液，100V，40mA条件下电泳50 min，溴化乙啶（Ethidium Bromide, EB）染色，凝胶成像仪拍照。
1.4 统计学方法 通过SPSS 13.0 软件根据PCR电泳条带不同及Jaccard遗传相关系数分析，相似系数大于0.8视为同一型。
2 结果
2.1 通过RAPD可以扩增出14条条带，结果见图1。
由图1可知，在500bp～2200bp之间，有6个固定条带，分别位于750bp、830bp、940bp、1200bp、1600bp、1800bp。它将81株菌株分为了8型。A型共57株，包括4个亚型，A3亚型有31株，A1亚型有18株，A2亚有2株，A4亚有6株；B型有11株，B4亚型5株，B1亚型有3株，B2和B3亚型各有1株和2株；C型有8株；D型～H型各为1株。A型占全部菌株数的70%，主要由A1和A3两个亚型组成，有爆发流行趋势。
2.2 血培养阳性菌株结果 10株血培养阳性的MRSH菌株RAPD电泳图谱见图2，分型主要为A型，且都集中于血液科、ICU、移植病房[4]，见表1。
3 讨论
MRSH对绝大多数的抗菌药物耐药，虽然糖肽类抗生素中万古霉素与去甲万古霉素均无耐药菌株，但敏感性已经有所下降[4，5]。本次研究的81株MRSH对替考拉宁耐药菌株13株，中介31株，共占总菌株数的54.3％，因此及早发现其流行并予以积极控制有重要意义。
本次研究中，大多数菌株均含有750bp、830bp、940bp、1200bp、1600bp、1800bp这6条条带，RAPD-DNA带谱类似，说明临床分离的MRSH遗传上比较接近，型与型之间的差异比较小。
本次研究中不同科室间各种分型没有显著差别，但在移植病房中与ICU均有较高分离率，也证明了在介入操作比较多的科室MRSH已经成为了导致感染比较重要的病原菌。而普通病房中流行的MRSH分型与移植病房、ICU基本相同也说明了在科室与科室之间存在着基因型的定植传播，MRSH感染病人、定植患者的流动是其主要传播方式，而通过医护人员为中介等传播方式目前也被广泛关注。
目前MRSH的感染情况严重，药物的选择有限，已经成为医院感染常见致病菌。因此早期发现MRSH在院内的流行，才能积极有效的对其进行控制，阻断其进一步传播。传统的方法如噬菌体法分辨力低，分型的能力也较差。而脉冲电场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis ，PFGE）和RAPD都是研究MRSH分子流行病学的有力工具，但是PFGE需时长，对操作要求较高，无法及时得到所需的流行病学结果，而RAPD在反应体系及引物已经确定的情况下，既可以随时进行，又可以得到相对可靠的结果，因此可以作为判断医院感染流行的初筛工具。
【】
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