加味桔梗汤对 LPS 致急性肺损伤大鼠血清TNF -α、IL-1、IL-10 含量的影响
作者：郑丰杰 李宇航 李丽娜 李鹏英 王庆国
【摘要】 目的：观察 TNF -α、IL-1β、IL-10 内毒素（LPS）所致急性肺损伤（ALI）发病过程中的作用及加味桔梗汤 ALI 的作用机制。方法：采用股静脉注射 LPS（5 mg/kg）建立大鼠 ALI 模型。采用 ELISA 法检测不同时相大鼠血清 中 TNF -α、IL-1β、IL-10 的含量，评价加味桔梗汤对其的影响。结果：LPS 诱发 ALI 过程中，大鼠血清 TNF -α、IL-1β及 IL-10 水平均显著高于正常组（P < 0.01）；以加味桔梗汤保护的大鼠血清中 TNF -α、IL-1β及 IL-10 的含量均明显降低（P < 0.01），且 IL-10 幅度最大。结论：TNF -α、IL-1β及 IL-10 在 LPS 诱导的 ALI 过程中起着重要作用；ALI 过程中，存在促炎/抗炎反应失衡，抗炎反应亢进；加味桔梗汤可以抑制 TNF -α、IL-1β及 IL-10 的释放，并抑制亢进的抗炎反应，对肺脏有一定的保护作用。
【关键词】 急性肺损伤；加味桔梗汤；白介素 1；白介素 10；肿瘤坏死因子
内毒素脂多糖（LPS）作为革兰阴性菌的主要抗原性及致病性成分，具有广泛的生物活性，是一些炎症介质和细胞因子的强诱导剂。对内毒素致肺损伤机制的研究表明，其致伤作用主要在于它的始动作用，其诱发的炎性细胞因子对组织细胞的损害远远超过内毒素本身；故有学者将其作用形容为“扳机”而不是“子弹”作用。目前认为参与 ALI/ARDS 的炎症介质超过 40 种，其中最重要的也是研究最多的是促炎细胞因子（TNF -α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、IFN -γ等）和抗炎细胞因子（IL-10、IL-4、IL-13、TGF -β等）。由于这些炎症因子的多效性和相互作用，其调控机制十分复杂，单一抗炎策略很难奏效。因此，充分发挥中医复方的多成分、多环节作用特点，可能取得一定的突破。本实验通过检测各组大鼠血清中 TNF -α、IL-1β及 IL-10 这 3 种较有代表性的细胞因子的含量探讨加味桔梗汤治疗内毒素性肺损伤的机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
内毒素脂多糖（SIGMA；L2880）；电热恒温孵育箱；全波长酶标仪。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组及模型制作 SD 大鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司提供）雄性，体重（200±10）g，动物购来后适应性饲养 3 d，实验前禁食过夜，自由饮水；按随机数字表法随机分为 7组。 正常对照组（N 组，n = 9）：与其余各组同步饲养，每天灌服与 J 组相应量的生理盐水；造模当天，股静脉注射生理盐水（5 mg/kg）。 ALI 模型组（M 组，n = 27）：与其余各组同步饲养，每天灌服与 J 组相应量的生理盐水；造模当天，分别于股静脉注射 LPS[1]（5 mg/kg）后 2 h（M2 组）、4 h（M4 组）、6 h（M6 组）后腹主动脉取血处死，每组 9 只。
加味桔梗汤组（J 组，n = 27）：与其余各组同步饲养，提前灌服加味桔梗汤 6 d，造模当天分别于股静脉注射 LPS（5 mg/kg）后 2 h（J2 组）、4 h（J4 组）、6 h（J6 组）后，腹主动脉取血处死，每组 9 只。
1.2.2 血清 TNF -α、IL-1、IL-10 含量的检测 TNF -α、IL-1、IL-10 ELISA 试剂盒购自北京晶美科技有限公司。腹主动脉取血，静置 4 h 后，离心分离血清，严格按试剂盒说明书操作。
1.3 统计学分析
实验数据采用统计软件 SPSS 11.5，所有数据均采用均数±标准差（x±s）表示，多组均数采用单因素方差分析，组间两两比较用 q 检验。
2 结 果
2.1 大鼠血清 TNF -α含量的测定
与正常组相比，2 h、4 h 时模型组大鼠血清中 TNF -α显著升高（P < 0.01），2 h 时达到高峰；而后逐渐下降，在 6 h 时间点趋于正常，4 组间差异无显著性。与同时相模型组相比，J2、J4 组大鼠血清 TNF -α含量均显著降低（P < 0.01）；6 h 时 4 组间差异无显著性（P > 0.05），结果见表 1。
2.2 大鼠血清 IL-1β含量的测定
与正常组相比，各时相模型组大鼠血清中 IL-1β含量显著升高（P < 0.01），2 h 时达到高峰，而后逐渐下降。与同时相模型组相比，加味桔梗汤组各时间点大鼠血清 IL-1β含量均显著降低（P < 0.01），结果见表 2。
2.3 大鼠血清 IL-10 含量的测定
与正常组相比，各时相模型组大鼠血清中 IL-10 含量显著升高（P < 0.01），并呈逐渐升高趋势。与同时相模型组相比，加味桔梗汤组各时间点大鼠血清 IL-10 含量均显著降低（P < 0.01），以 6 h 点最为显著，结果见表 3。
3 讨 论
内毒素一旦侵入机体，便可引起一系列级联放大的病理反应，其诱发的炎性细胞因子对组织细胞的损害远远超过内毒素本身对机体的直接影响；在细胞水平其影响主要表现为炎症细胞趋化、游走、聚集浸润及活化；在分子水平则主要是表达细胞因子的基因激活和炎症介质的升高。如前炎症细胞因子 TNF -α、IL-1、IL-6、IL-8 等和抗炎介质 IL-4、IL-10、IFN -γ等均与 ALI/ARDS 的发病和死亡关系极为密切[2]。其中 TNF -α、IL-1β是主要的快速反应促炎介质，在机体（或细胞）遭受损伤、感染，或 LPS 等刺激后短时间内即可出现，4~6 h 内迅速达到高峰，是启动促炎及抗炎瀑布级联反应的最上游介质，在一定程度上可反映病情的变化。IL-6 由 TNF -α、IL-1 诱生，是主要的促炎细胞因子之一，是机体损伤后肝脏合成各种急性期反应蛋白的重要诱生剂，与全身炎症反应综合征的发生有较为直接的关系，被认为是反映全身炎症反应综合征、脓毒症、多脏器功能衰竭等危重病人病情变化及预后的一个重要指标。IL-10 被认为是体内最重要的抗炎细胞因子，具有广泛的抑炎、免疫抑制作用，可减轻过度炎症反应对机体的损害，但另一方面可造成机体免疫功能的下降，导致对感染的易感性增加。
循环血液中炎症介质大量增加是全身炎症反应的物质基础，炎症细胞因子不仅作为效应分子在炎症反应中发挥作用，而且是炎症反应的信号分子，因此外周血液中炎症细胞因子的水平往往可以反映全身炎症反应的进程和程度。本实验观察了 TNF -α、IL-1β、IL-6 及 IL-10 在内毒素急性肺损伤模型大鼠血清中的动态变化，并通过观察加味桔梗汤对其各个时间点的调节作用探讨宣肺解毒法急性肺损伤的可能机制。
本研究采用股静脉注射 LPS（5 mg/kg）复制ALI 模型。结果显示，注射 LPS 后大鼠血清中 TNF -α、IL-1β、IL-6、IL-10 含量均明显升高，可以认为 LPS 诱导了急性肺损伤的炎性反应；同时表明LPS 进入体内可使 TNF -α的合成或分泌亢进，致炎因子 TNF -α、IL-1β、IL-6 和抗炎因子 IL-10 均参与了急性肺损伤的病理变化过程[3]。与同一时相正常组相比，促炎因子 TNF -α、IL-1β、IL-6 含量分别增加约 10 倍、3 倍、2 倍，而抗炎因子 IL-10 的含量在 ALI 早期就增加 30 倍以上，且随病程而持续增加；这种变化导致促炎/抗炎失衡，TH1 向 TH2 漂移[4]，而 ALI 时抗炎反应增强的后果时机体细胞免疫功能低下，这与蒋雄斌[5]、Mark VE[6]等报道一致。本实验发现加味桔梗汤方对动物血清中炎性介质的释放均有明显的抑制作用，大鼠血清中 TNF -α、IL-1β、IL-6 含量较同时间点的模型组均显著降低；而 IL-10 水平降低幅度远高于促炎因子 TNF -α、IL-1β、IL-6 的幅度，使促炎因子/抗炎因子趋向平衡，抑制急性肺损伤病程中出现的过度的抗炎反应；这说明通过抑制 TH1 向 T H2 漂流，改善促炎/抗炎的失衡状态可能是加味桔梗汤治疗急性肺损伤的机制之一。其具体调节促炎/抗炎平衡的机制有待于通过连续的动态的观测促炎因子 TNF -α、IL-1β、IFN -γ及抗炎因子 IL-4、IL-10 的mRNA 基因表达进一步证实，这将是我们今后进一步研究的方向。
【】
〔1〕史雪梅, 黄亮, 曹春水, 等. 丹参酮IIA对大鼠急性肺损伤保护的实验研究〔J〕. 中华结核和呼吸杂志, 2005, 28(5): 350-351
〔2〕Waage A, Brandtzaeg P, Halstensen A, et al. The comple pattern of cytokines in serum with meningococcal septic shock. Association between interleukin 6, interleukin 1 and fatal outcome〔J〕. J Exp Med, 1989, 169:333-338
〔3〕焦炳华. 分子内毒素学〔M〕. 上海:上海技术文献出版社, 1995. 426-456
〔4〕冯英凯, 徐剑铖, 杨庆华, 等. 内毒素肺损伤大鼠TH1/TH2细胞漂移的变化及其作用探讨〔J〕. 重庆医学, 2004, 33(10):1511-1514
〔5〕蒋雄斌, 邱海波. 急性肺损伤时TH1/TH2平衡变化及意义探讨〔J〕. 江苏大学学报, 2003, 13(3):202-204
〔6〕Mark VE, McCarter MD, Naama HA, et al. Dominance of T-Helper2-type cytokines after severe injury〔J〕. Arch Surg, 1996, 131:1303-1309
