磁流体与长春新碱对系统血液免疫功能影响的实验研究
作者：王莉莉 钱宝华 郭峰 花美仙
【摘要】 目的：用体外实验体系对纳米级 Fe3O4 磁流体和抗癌药物长春新碱（VCR）体外对系统血液免疫功能的影 响进行分子水平的探讨。方法：采用免疫荧光标记流式细胞仪分析方法，检测血细胞表面相关免疫分子的变化情况。结果：使用纳米级 Fe3O4 磁流体和抗癌药物 VCR 以后，自然实验组 CD4 细胞阳性率（38.87±6.37）% 较自然对照组（35.52±6.76）%明显增高（P < 0.01），自然实验组白细胞 CD55 阳性细胞平均荧光强度（68.79±8.98）% 较自然对照组（74.78±18.60）%明显降低（P < 0.05）。与自然对照组相比 CD4 分子均表现出一定程度的上调，CD8 分子均表现出一定程度的下调。结论：VCR（0.2 g/mL）和纳米级 Fe3O4 磁流体对血细胞的免疫功能都没有不良影响，甚至磁流体还可以提高血液免疫反应中白细胞的免疫功能，为红细胞包载磁流体和抗癌药物肿瘤提供实验依据，为抗癌药红细胞载体靶向抗肿瘤免疫提供新的治疗途径。
【关键词】 红细胞；磁流体；长春新碱；靶向；CD4；CD8；CD55；CD59
〔Abstract〕 Objective To research the molecular level effects of Fe3O4 nano-magnetic ferrofluid and anticancer drug vincristine (VCR) on systemic hematogenic immunologic function by means of natural experimental system in vitro. Methods The expression of correlated moleculars on the surface of blood cells were detected and compared using flow cytometry assay. Results The level of CD4 on T cells (38.87±6.37)% in natural experimental group was significantly increased than that of natural control group (35.52±6.76)% (P < 0.01), while the mean fluorescence intensity of CD55 in natural experimental group (68.79±8.98)% was much lower than that of natural control group (74.78±18.60)% (P < 0.05). Compared to natural control group, the expression of CD4 was up-regulated in some degree while CD8 was down-regulated in experimental group. Conclusion VCR (0.2 g/mL) and Fe3O4 nano-magnetic ferrofluid have no harmful effects to hematogenic immunologic function. Magnatic ferrofluid can even elevate the function of leucocytes. The results can supply experimental foundation for erythrocytes to capsulate both magnetic ferrofluid and anticancer drug, and also can provide treatment pathway for anticancer drug erythrocyte carrier targeting antitum or immunity.
〔Key Words〕 Erythrocytes; Magnetic ferrofluid; Vincristine; Targeting; CD4; CD8; CD55; CD59
纳米级 Fe3O4 磁流体（magnetic ferrofluid, MF）是目前国内外靶向给药和医用高分子材料研究领域的热门方向之一。磁流体因具有独特的性质（流动性、磁响应性、靶向可控性）而应用广泛，与技术相结合使用则更加显示其优越性。长春新碱（VCR）是临床常用的抗肿瘤药物，抗肿瘤谱广。有关研究资料已经证明，红细胞作为 VCR 载体可减少用药量和提高疗效[1]，但其靶向性差，还有待于深入研究。我们设想用红细胞双载 VCR 和磁流体，借助于外加磁场以解决 VCR 红细胞载体的靶向问题。此前首先要弄清磁流体对机体生理功能的影响，特别是对免疫功能是否有负面影响。我们想利用现代系统免疫学理论与方法[2]研究磁流体和 VCR 联合应用对系统血液免疫功能是否有正负影响，目前尚未见到这种报道，现将有关资料报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
酸性枸橼酸钠葡萄糖溶液（acid citrate dextrose, ACD）抗凝的健康成人新鲜全血由人民解放军上海血站提供，其中男 2 例，女 9 例，中位年龄 30 岁。鼠抗人 CD55-FITC、CD59-PE、CD3/4、CD3/8 等直接法荧光单克隆抗体购自美国 BD 公司。注射用硫酸长春新碱粉针剂（国药准字 H44021772，批号 0609V1）购自深圳万乐药业有限公司，以 0.9% 生理盐水配制成浓度为 0.2 g/mL 待用。纳米级 Fe3O4 磁流体〔含超顺磁性氧化铁（SPIO）氨基硅烷 Fe3O4 纳米颗粒，直径 8~12 nm〕由上海大学纳米科学与技术工程中心惠赠，样品使用前均以超声波处理 10~15 min，使 Fe3O4 粒子分布更均匀。流式细胞仪（BD FACS Calibur, USA），分析软件为 Cell Quest。
1.2 方法
1.2.1 预备实验：血浆及全血细胞悬液的制备 新鲜采集的健康成人 ACD 抗凝全血 4~5 mL，室温下 2 500 r/min，离心 5 min，吸取上层血浆至另一试管备用。将上述全血细胞用 0.9% 生理盐水（NS）洗涤并 2 500 r/min，离心 5 min 2 次，用 NS 恢复原体积，混匀即为全血细胞悬液。
1.2.2 正式实验：自然反应实验体系的设计 每管加入 0.3 mL 血浆和 0.2 mL 全血细胞悬液，除自然对照组加入 0.2 mL NS 以外，自然实验组分别加入0.1 mL VCR、0.1 mL MF 或 0.1 mL NS。即：
试管 1：0.3 mL 血浆 + 0.2 mL 全血细胞悬液 + 0.1 mL VCR + 0.1 mL MF（自然体系实验 1 组）。
试管 2：0.3 mL 血浆 + 0.2 mL 全血细胞悬液 + 0.1 mL MF + 0.1mL NS（自然体系实验 2 组）。
试管 3：0.3 mL 血浆 + 0.2 mL 全血细胞悬液 + 0.1 mL VCR + 0.1 mL NS（自然体系实验 3 组）。
试管 4：0.3 mL 血浆 + 0.2 mL 全血细胞悬液 + 0.2 mL Ns（自然体系对照组）。
将上述试管混匀后置于 37℃水浴箱中温育 1 h，加盖防止水蒸气进入。中间轻轻摇匀 2 次，使反应充分进行；取出后 2 500 r/min，离心 5 min；小心取出上清液，将沉淀物用 2 mL PBS 重悬，2 500 r/min，离心 5 min，弃上清，加入 200 L PBS 使其体积为 200 L。
1.2.3 流式细胞仪检测血细胞表面相关免疫分子 红细胞表面分子 CD55、CD59 检测：取待测样品 1 L、PBS 缓冲液 50 L、 CD55-FITC、CD59-PE 单抗 4 L，充分混匀，室温避光 20 min；再加入2 mL PBS 液，1 000 r/min，离心 5 min，弃上清，加入 400 L PBS，立即上流式细胞仪检测。
白细胞表面分子 CD55、CD59、CD4、CD8 检测：取待测样品 50 L，每管加入红细胞裂解液 1 mL，室温避光反应 10 min，1 000 r/min，离心 5 min，弃上清，加入 CD55-FITC、CD59-PE 抗体各 4 L，CD3/4、CD3/8 抗体各 3 L，充分混匀后室温避光 20 min；抗体结合后，再加入 2 mL PBS 液，1 000 r/min，离心 5 min，弃上清，加入 400 L PBS，立即上流式细胞仪检测。
1.3 统计学处理
实验数据以 x±s 表示，统计学处理采用 t 检验。
2 结 果
2.1 磁流体（MF）对系统血液免疫功能的影响
自然体系实验 2 组白细胞CD55 阳性细胞平均荧光强度低于自然体系对照组（P < 0.05）。与自然体系对照组相比，自然体系实验 2 组 CD4 分子、红细胞 CD59 分子、白细胞 CD59 分子表现出一定程度的上调，CD8 分子、红细胞 CD55 分子表现出一定程度的下调，但差异无统计学意义。其指标结果详见表 1。
2.2 长春新碱（VCR）对系统血液免疫功能的影响
与自然体系对照组相比，自然体系实验 3 组CD4、CD8、白细胞 CD59 分子表现出一定程度的上调，红细胞和白细胞 CD55 分子表现出一定程度的下调，但差异无统计学意义。其指标结果详见表 1。
2．3 磁流体（MF）和长春新碱（VCR）混合物对系统血液免疫功能的影响
与自然体系实验 3 组相比，自然体系实验 1 组CD4 分子、红细胞 CD59 分子、白细胞 CD59 分子、白细胞 CD55 分子表现出一定程度的上调，但差异无统计学意义。其指标结果详见表 1。
与自然体系对照组相比，自然体系实验 1 组 CD4 细胞阳性率明显高于自然体系对照组（P < 0.01）。其中红细胞 Cd59 分子、白细胞 CD59 分子均表现出一定程度的上调，但差异无统计学意义。其指标结果详见表 1。
2.4 各组内指标之间的相关性
体系实验 1 组中 RCD55 与 RCD59、WCD55 与 WCD59 显著正相关（P 值分别为 P < 0.01、P < 0.01），RCD55 与WCD59、RCD59 与 WCD59、CD4 与 WCD55、CD4 与 WCD59 成正相关，但相关性无统计学意义。其指标结果详见表 2。
自然体系实验 2 组中 RCD55 与 RCD59、RCD55 与 WCD59、RCD59 与 WCD59、CD4 与 WCD59 显著正相关（P 值分别为 P < 0.01、P < 0.01、P < 0.05、P < 0.05），WCD55 与 WCD59、CD4 与 WCD55 成正相关，但相关性无统计学意义。其指标结果详见表 2。
自然体系实验 3 组中 CD4 与 WCD55、CD4 与 WCD59、WCD55 与 WCD59 显著正相关（P 值分别为 P < 0.05、P < 0.01、P < 0.01），RCD55 与 RCD59、RCD59 与 WCD59 成正相关，RCD55 与 WCD59 成负相关，但相关性无统计学意义。其指标结果详见表 2。
自然体系对照组中 RCD55 与 RCD59、RCD59 与 WCD59、CD4 与 WCD59 显著正相关（P 值分别为 P < 0.05、P < 0.05、P < 0.05），WCD55 与 WCD59 成正相关，CD4 与 WCD55、RCD55 与 WCD59 成负相关，但相关性无统计学意义。其指标结果详见表 2。
3 讨 论
自 1981 年 Siegel 提出“红细胞免疫系统”全新概念以来，人们开始认识到红细胞不仅在运输 O2、CO2 和清除循环免疫复合物等方面发挥功能，而且在机体天然免疫屏障方面也具有重要作用。红细胞表达多种免疫相关分子，较为重要的有 CD55、CD59 等。CD59 又称为保护素、同种限制因子-20，它通过与 C7、C8 或 C9 的结合而阻止膜攻击复合物（MAC）的组装，防止 MAC 对同种或自身细胞的溶解破坏，保护宿主细胞免受补体介导的损伤。CD55 即衰变加速因子（DAF），其分子基础和化学构成与 CD59 相似，可竞争性与 C3b 结合，阻止C3、C5 转化酶的装配，并加速已形成的 C3、C5 转化酶衰变，从而抑制补体攻击单位的活化。
机体免疫过程中，T 淋巴细胞发挥着重要作用。研究表明，使用纳米级 Fe3O4 磁流体和抗癌药物 VCR 以后，与自然对照组相比 CD4 和 CD8 分子分别表现出一定程度的上调和下调，说明无论是 VCR （一定剂量范围内），还是纳米级 Fe3O4 磁流体对白细胞的免疫功能都没有不良影响，甚至一定程度上还可以提高白细胞的免疫功能。由于 T 淋巴细胞的分型和功能有着密切相关性，使用磁流体和 VCR 以后对于 CD4+ CD25+ 和 CD4+ CD25- T 淋巴细胞、CD8+ CD28+ 和 CD8+ CD28- T 淋巴细胞的影响有待于进一步深化研究。
我们的研究发现，使用了 VCR 以后，CD4、CD8、白细胞 CD59 分子表现出一定程度的上调，红细胞和白细胞 CD55 分子表现出一定程度的下调。众所周知，常规剂量抗癌药能明显破坏细胞的免疫功能，然而有资料表明低剂量化疗药却可以提高细胞免疫功能[3]，这与我们的研究（VCR 0.2 g/mL，明显低于临床常规剂量）一致，但差异无统计学意义，分析可能由于实验例数太少所致。
我们的研究表明使用了 MF 以后 CD4 与 WCD59 显著正相关（P < 0.05），CD4 与 WCD55 成正相关，使用了 VCR 以后 CD4 与 WCD55、CD4 与 WCD59 显著正相关（P 值分别为 P < 0.05、P < 0.01），共同使用 VCR 和 MF 以后 CD4 与 WCD55、CD4 与WCD59 成正相关，与自然体系对照组 CD4 与WCD59 显著正相关（P < 0.05）类似。有报道指出，CD55 可以分别刺激 CD4、CD8 表达[4]。CD4+ 或CD8+ T 细胞生长至少部分依靠 Cd59 分子，但是CD8+ T 细胞比 CD4+ T 细胞敏感[5]；CD59 表达下降与 CD8+ T 细胞关系密切，而非 CD4+ T 细胞[6]。后者报道与我们的实验有些不符，但具体机制还有待于进一步研究。从以上分析，我们可以认为纳米级 Fe3O4 磁流体和抗癌药物 VCR 合用对血细胞的免疫活性有上调作用。
Fe3O4 磁流体在生命领域里的应用越来越广泛，如可作为生物医药领域中磁共振成像的造影剂[7]，与抗体结合用于生物分离[8]，与外部磁场结合用于监测肿瘤化疗效果[9]等，尤其在肿瘤领域以及磁流体热疗[10]等，都为肿瘤的治疗带来了新的契机和希望， 同时也使其生物安全性受到人们的重视。通过本实验，我们认为医用纳米级 Fe3O4 磁流体对系统血液免疫功能有良好的上调作用，可用于靶向治疗，体现了医学界所追求的高效低毒甚至无毒的目标。
红细胞可用作多种抗癌制剂的载体[11]。VCR 是临床常用的抗肿瘤药物，抗肿瘤谱广，作用于细胞周期的 M 期，主要用于治疗急性淋巴性白血病、霍奇金病和恶性淋巴瘤。本文采用的 VCR 剂量在红细胞的载药剂量范围内，用量微小，对血液免疫功能有上调作用，可避免临床 VCR 常规用量的免疫抑制作用。我们认为 VCR 载体红细胞的制备技术和生物学特性研究[1]现已经比较成熟。如果将药物载体红细胞技术与磁性药物传输系统的研究结合起来，既可以改善药物载体红细胞靶向性单一的不足，又可以有效解决磁性药物载体在安全性、生产成本和载药量等方面的缺陷，从而使红细胞成为良好的靶向给药载体，改变肿瘤化疗策略，扩大红细胞输血治疗的临床应用。通过体外自然体系实验的研究，仿真磁流体和 VCR 在体内对血液免疫功能的影响，为红细胞包载磁流体和抗癌药物治疗肿瘤提供实验依据，为靶向抗肿瘤免疫提供新的治疗研究思路和方法。
【】
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