地塞米松诱导小鼠腭裂动物模型的建立

                作者：刘贤 齐志丽 刘杨 田悦明 王浩宇 吴靖芳 郑慧娥 任君旭 安峰

【摘要】  目的：探讨地塞米松诱导小鼠腭裂动物模型的建立方法。方法：采用一次性腹腔注射地塞米松的方法，建立腭裂模型鼠。取孕12.5d、13.5d、14.5d、15.5d、16.5d胚胎头部，石蜡包埋，6μm切片，HE染色，观察腭发育过程腭突的变化。结果：妊娠第11.5d一次性给予地塞米松(Dex)1mL(用量为50mg/Kg)可诱发小鼠产生腭裂。模型组腭突体积瘦小，不能在中线区接触融合，以致不能与腭突上方的鼻中隔接触融合，胎鼠出现腭裂。结论：妊娠第11.5d一次性给予小鼠足量地塞米松，可成功建立腭裂动物模型。为研究腭裂形成原因及分子机制提供了一个较好的模型。

【关键词】  地塞米松；腭裂；模型/动物

    【ABSTRACT】  Objective：To investigate the method of constructing the model of cleft palate induced by dexamethasone(DEX)．Methods：The cleft palate mouse embryo model was got by injecting DEX intraperitoneally into Kunming mice．The heads of the mouse?s embryo were got  from GD12.5 to GD16.5,then fixed with Bouin?s solution,embedded by paraffin,sectioned 6μm and HE stained．The changes of palatine process were observed during the development course of cleft．Results:Cleft palate at GD 11.5 could be induced by injecting DEX at the dose of 50mg/kg once.The palatine process and anasl septum,which could not contact and merge each other,was thin and small in the model group so as to develope palate cleft on the embryo．Conclusion:Injecting enough dose DEX once at GD11.5 can induce the cleft palate mouse embryo model successfully．It is a perfect model for studying the reasons and mechanism of cleft palate forming．

    【KEY WORDS】  Dexamethasone,Cleft Palate,Models/Animal

     腭裂动物模型在腭裂病因学、形成机制及方法等研究中具有重要作用[1]。先天性腭裂的发生率约为0．1%，其发生主要是由于早期发育过程中腭突融合障碍所致，通常是遗传及环境因素相互作用的结果，其中妊娠早期误服药物也可能是其发生原因之一。在胚胎发育过程中腭的正常发育在很大程度上取决于环境因素，与腭裂发生有着密切的关系。胚胎腭器官发生期是器官的形成过程，同时又是胚胎的致畸敏感阶段。本实验拟通过对胚胎发育的渐进性形态学观察，揭示腭发育及腭裂形成过程，从而建立腭裂动物模型。

    1  材料与方法

    1．1  实验动物

    成年健康未生育昆明小鼠（体重为22～25g）（北京大学医学部实验动物中心），胎鼠为孕12.5d、13.5d、14.5d、15.5d、16.5d（足月为19～21d）。

    1．2  实验材料

    试剂：醋酸地塞米松注射液（华北制药集团）、PBS液（0．01M）、Bouin?s固定液、酒精、苏木精?伊红染液、生理盐水；仪器：OLYNPUS BX?31，Motic 6.0医学图像分析系统和手术器械，如镊子、解剖刀、解剖剪、止血钳、注射器、培养皿。

    1．3  模型的建立方法

    随机选取健康、生活状态相近的小鼠，雌雄按2∶1于晚18∶00合笼，并于次日早7：30检查雌性小鼠的阴栓，查见阴栓之日定为孕0d（0GD），第11天14∶00定为孕11.5d（11.5GD）[2]。所有小鼠均自由饮水及标准小鼠饲料喂养，孕鼠随机分为模型组和对照组，每组各20只孕鼠。模型组孕鼠于妊娠第11.5d腹腔内注射50mg/Kg地塞米松，诱发胚胎腭裂畸形；对照组孕鼠于妊娠第11.5d腹腔内注射等量生理盐水。各组孕鼠分别于12.5d、13.5d、14.5d、15.5d、16.5d以颈椎脱臼法处死，并立即于冰块上操作，剖腹取出胎鼠。

    1．4  取材方法

    取出胎鼠的方法：孕鼠处死后取仰卧位，立即放置于冰块上固定，在小鼠腹中线最底部阴道口上方皮肤剪开“一”字形切口，然后向头部作“U”形皮瓣，充分暴露腹腔器官。其中可见双角子宫位于腹腔的两侧以及带有胎盘和羊膜的胚胎成串珠样排列于子宫中，不同生长期的胎鼠体积大小不一。用剪子分离子宫与阴道相连的部位，取出胎鼠立即放至盛有冷PBS液（4℃，0.01M pH 7.2～7.4）的培养皿中，并用镊子剥离胎盘和羊膜，PBS洗涤，Bouin固定液24h，使固定液充分穿透组织。

    分离胎鼠头部方法：由于胎鼠体积大小不一，12.5d、13.5d、14.5d的胚胎在包埋前头部与身体可不分离。15.5d、16.5d的胎鼠沿口裂与耳廓连线的平行线自颈部断头，分离时避免伤害小鼠头部。分离的小鼠头有去下颌、不去下颌两种。去下颌应用镊子打开胚胎口部，刀片切除下颌，眼科镊子取出舌，以便于观察小鼠是否有腭裂。分离后的小鼠头重新固定于Bouin?s液中。

    1．5  切片、染色

    制作方法：12.5d、13.5d、14.5d的整个胚胎、15.5d、16.5d的鼠头梯度酒精脱水、浸蜡后常规石蜡包埋，包埋时小鼠喙部朝下。12.5d、13.5d、14.5d的胎鼠须经溶蜡后取头重新包埋。包埋好后准备用于切片，切片时以麦克尔软骨为基准面，作冠状位连续切片，切片厚约6μm。石蜡切片经脱蜡、水化、蒸馏水洗涤、苏木精染色、自来水洗、0.5%盐酸酒精分化、自来水蓝化、伊红染色、脱水、透明、封片，光镜观察。

    2008年6月刘  贤等：地塞米松诱导小鼠腭裂动物模型的建立第3期2008年6月河北北方学院学报（医学版）第3期2  结果

    2．1  肉眼观察

    肉眼观察只适用于15.5GD、16.5 GD去下颌的胎鼠。通过观察可以发现在胎鼠腭部正中有一边缘不太规整的裂隙，其长度、宽度不一，长度一般为1.5～3.0cm（图1）。不同时期的胎鼠裂的大小不同，形状也不尽相同。

    图1  体视镜（4×）观察可见胎鼠腭部正中裂隙2．2  不同时间胎鼠腭裂的形态学观察

    HE染色切片光镜下观察可见：GD12.5的胎鼠：模型组、对照组二者腭的发育程度无明显差别，即均为舌体位置较高，几乎与鼻中隔相连，腭突沿舌体两侧垂直向下生长（图2，3）。GD13.5：对照组的胎鼠其舌体开始下降，腭突开始上抬；模型组可见由于一侧或两侧舌体下降延迟导致一侧或两侧腭突上抬延迟以至影响了后期腭突的生长及其上皮的融合，导致了后期腭裂的形成（图4，5）。GD14.5：对照组的胎鼠其舌体降至口底，腭突完全上抬至舌体上方并呈水平方向相对生长，部分腭突相互接触，中间嵴上皮在中线区形成上皮中缝；模型组腭突位于舌体两侧并开始上抬（图6，7）。GD15.5：对照组腭突接触融合，上皮中缝消失，间充质细胞相互连接形成完整的腭器官；模型组腭突在舌体上方呈水平生长，但体积较小，不能在中线区相互接触，腭裂形成，或即使接触亦不能融合，最终形成腭裂（图8，9）。GD16.5：对照组两侧腭突与鼻中隔相接触上皮融合并发生凋亡（细胞程序化死亡，PCD），中胚层间充质组织相互穿过，腭器官分化发育，至此腭器官的发育基本完成，模型组腭突瘦小，不能与鼻中隔完全接触，腭裂形成。其形态学观察如图（图10，11）。腭裂有完全性腭裂、不完全性腭裂（单侧腭裂）两种（图12，13）。

    2．3  数据处理

    经统计学处理，对照组小鼠取出的胎鼠极少发现腭裂形成，模型组产生了腭裂。地塞米松诱导小鼠腭裂，其畸形率为59.48%。统计数据如表1所示。 表1  对照组和模型组胚胎畸形率比较

    3  讨论

    复制实验性腭裂动物模型的方法比较多，按诱导方法的不同，主要分为两类：一类是外科手术诱导的动物模型，多用于腭裂临床方法的探索；另一类是先天性腭裂动物模型，主要用于腭裂病因学和发生机制方面的研究[1]。目前多用地塞米松、全反式维甲酸等药物制备腭裂动物模型，而地塞米松被认为是近20年致畸研究中的一种具有较强致畸性的糖皮质激素制剂。地塞米松为一种糖皮质激素，具有抗炎症作用及孕期致胚胎畸形的副作用。傅豫川等按不同给药时间、不同给药剂量，以醋酸地塞米松为致畸药物，诱发远交系NIH小白鼠胚胎腭裂，成功建立了腭裂动物模型。其结果显示：1.妊娠第12d为最佳致畸时间，2.50mg/Kg醋酸地塞米松为最佳致畸量[2]。因此，我们选取50mg/Kg的地塞米松妊娠第11.5d腹腔内注射，对小鼠进行实验。从实验结果看，妊娠第11.5d腹腔注射50mg/Kg的地塞米松对小鼠有较高的致畸率。

    Abbott等[3]认为糖皮质激素可通过改变胚鼠腭部特定区域生长因子水平影响腭部某些细胞PCD水平，并因此产生腭突瘦小导致腭裂；也有些学者认为糖皮质激素可作用于孕鼠的肾上腺皮质，使ACTH分泌增加，而ACTH能抑制腭突及头部各突起的间充质增生[4]。也有人认为糖皮质激素可能影响腭突的上抬并通过抑制前列腺素产物诱发腭裂，因为前列腺素可能影响肌肉收缩细胞能动性和溶酶体活力，并提出了糖皮质激素受体学说。他在动物实验中证实了糖皮质激素受体是一个致畸胎作用的生物化学位点，该位点可干扰蛋白质的合成[5]。另外，也有学者认为糖皮质激素的致畸作用与胚胎染色体中的某些基因有关，Gasser[6]称之为敏感性基因密码。

    人类腭裂与小鼠腭裂在形态发生和病理形成方面有着相似性。小鼠腭裂被认为是一种常用的动物模型[2]。从胚胎学上来讲，腭裂的产生主要体现在以下两个环节:一是在腭器官发育早期，腭突不能上抬或上抬延迟，最终使两侧腭突不能接触而产生腭裂[7];二是在腭器官发育晚期，两侧腭突尽管能够接触，但接触后不能融合或融合后再裂开而产生腭裂[8]。上述两个环节任何一个发生在胚胎发育过程中，都可导致腭裂。在胚胎的发育和形态发生中均存在有细胞凋亡（细胞程序化死亡，PCD），而凋亡模式的改变往往导致畸形的发生。在颅面部发育过程中，新生细胞建立联系是通过细胞迁移、诱导生长及凋亡实现的。

    在本实验中，虽有部分注射地塞米松的小鼠建立腭裂模型并未成功以及有部分孕鼠解剖发现死胎、溶胎，这可能与不同小鼠对药物的敏感性、耐受性不同有关，但是总体来看动物模型建立是成功的。从胎鼠腭裂的形态学观察来看，舌体的下降延迟阻碍了腭突的上抬及水平方向相向生长，以至腭突体积瘦小不能向上与鼻中隔相互接触融合，导致了胎鼠腭裂的形成。从本实验结果看，腭器官的形成过程可分为六个时期，分别为：腭器官发生前期、腭突发生期、腭突垂直生长期、腭突上抬及水平生长期、腭突接触融合期、腭器官分化成熟期。腭器官发生前期为地塞米松致畸的敏感阶段，此时地塞米松的注射导致了胎鼠腭裂的形成。

    综上所述，本次实验基本建模成功，成功诱导了胎鼠腭裂，产生了完全性腭裂与不完全性腭裂。为进一步研究腭裂发病原因及分子机制提供了动物模型。

【】
  1 朱江波，张天宝.腭裂动物模型的研究现状[J].国外医学口腔医学分册,2005,32（2）:133?135

2 傅玉川,黄洪章,李祖兵.建立远交系小白鼠胚胎腭裂模型的实验研究[J].口腔医学杂志,1994,8（2）：70?73

3 Abbott BD，Harris MW，Birnbaum LS．Comparisons of the effects of TCDD and hydrocortisone on growth factor expression provide insight into their interaction in the embryonic mouse palate [J].Teratology，1992，45(1):35

4 张汇泉.人类畸胎学[M].北京:人民卫生出版社,1987,29:281

5 Dronamraju KR.Cleft lip and palate:Aspects of reproductive biology[M]．Charles C Thomas Pub Ltd.1986.81?107

6 Gasser DL．Recombinants in the H?2s/H2O interval of mouse chromosoma 17 define the map position of a gene for cleft palate susceptibilily[J]．Teratology,1988,38:571

7 Abbott BD，Harris MW，Birnbaamls.Etiology of retiaoic acid?induced，cleft palate varies with the embryonic stage[J].Teratology，1989,40:533?537

8 Kitamura H．Evidence for cleft palate as a postfusion phenomenon[J].Cleft Palata Craniofac J，1991,28(2):195?199