镧示踪甘露醇开放大鼠血脑屏障机制的实验研究

【摘要】  　　目的：研究甘露醇高渗性开放大鼠血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）的机制。方法：采用静脉内注射0.5 mL 2%硝酸镧作为外源性示踪剂，10 min后颈内动脉注射37 ℃ 20%甘露醇3.0 mL开放SD大鼠BBB，通过外源性硝酸镧透射电镜示踪法观察BBB超微结构改变，研究热点区域包括注射侧与对侧大脑皮层。结果：实验组（注射20%甘露醇组），镧（La3+）在同侧大脑半球皮质区充填并通过脑血管内皮细胞（BMECs）之紧密连接（TJs）至血管腔外-脑间质裂隙内，对侧大脑半球皮质区局部有La3+渗出至基底膜（BM）；对照组则完全封闭于血管腔内（P<0.05）；各部位胞浆内均无La3+。结论：20%甘露醇通过开放TJs导致BBB通透性增高，同侧大脑半球强于对侧大脑半球。

【关键词】  BBB 通透性 超微结构 甘露醇

    Abstract  Objective：To investigate the mechanisms of osmotic BBB  disruption induced by intra-carotid artery infusion of mannitol. Methods：Male SD rats underwent intravenous administration of 0.5 mL 2% lanthanum nitrate over 2 minutes.Ten minutes later,warm 20% mannitol was intra-arterially infused at a rate of 0.1 mL/second over 30 seconds.The interesting spots included cortical tissues within the ipisilateral and opposite hemisphere of the brain respectively. The ultrastructure of BBB was observed by lanthanum nitrate-tracing transmission electronic microscope.Results：In the brain tissues of control group,La3+ is excluded from TJs. However,for the trial group, TJs in the opposite hemisphere of the brain were completely infiltrated with La3+and extravasation to the basement membrane was seen in certain sites of the capillaries; La3+penetrated the cellular gaps of endothelia and seeped in the basement and interstitial spaces in ipisilateral hemisphere of the brain（P<0.05）.No La3+was seen in the cytoplasm of cerebral microvessel endothelial cells both in trial and control groups. Conclusion： Opened TJs result in the enhanced permeability of BBB induced by intra-arterial infusion of mannitol.

    Key words  BBB；Permeability；Ultrastucture；Mannitol

    大量研究表明：颈内动脉注射甘露醇所致的渗透性开放是非选择性的可逆性开放，且无组织损害［１］。但目前关于渗透性开放BBB的途径与机制尚存争议。本研究采用颈内动脉注射甘露醇开放SD大鼠BBB，通过外源性硝酸镧透射电镜示踪法观察BBB超微结构改变，探讨BBB开放的途径。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    健康雄性SD大鼠10只（体重250 g～300 g），四川大学华西医学中心基础实验动物中心提供；硝酸镧（成都化学试剂厂）。

    1.2  硝酸镧示踪电镜观察甘露醇开放BBB之超微结构改变

    SD大鼠2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（40 mg/kg）→颈部切口分离出右侧颈外静脉，用微型注射器缓慢注入0.5 mL 0.9%NS-2%硝酸镧（2 min）（硝酸镧的量和浓度与正常血脑屏障匹配）→循环时间为10 min→颈内动脉置PE-50聚乙烯管，37 ℃ 20%甘露醇0.1 mL/s 持续30 s颈内动脉注射→循环时间为10 min→开胸及心包膜，经左心室插管至升主动脉，右心房开小口，先用肝素化37 ℃ 0.9% NS 150 mL快速心脏灌流冲洗血液至无色（流出液基本清亮），随后镧醛固定液（2%多聚甲醛-2.5%戊二醛-2%硝酸镧-0.1M二甲砷酸钠（CBS）持续灌流固定20 min，灌注压1.0 kPa→开颅取全脑，选取不同部位组织切成小块，投入上述镧醛固定液中继续固定2 h。用含镧的0.1 M CBS（2%硝酸镧-0.1 M CBS）浸洗3次（10 min/次）。1%锇酸后固定，经含镧的0.1 M CBS浸洗3次（10 min/次）后，丙酮逐级脱水，包埋，修块，半薄切片光学显微镜定位，制备超薄切片，染色，最后电镜观察。其中，组织取材分为两组：双侧大脑半球皮质，每一区域随机取样3处。光镜下不能看到镧盐，故随机取样分析，以毛细血管丰富区域为超薄切片制备区域。对照组以0.9% NS替代20%甘露醇，余步骤相同。

    1.3  结果判定

    (1)血管对硝酸镧不通透的标准：La3+沉积于血管管腔面，管腔外无La3+（-）；(2)血管对硝酸镧通透的标准：La3+出现在以下部位①局部BM(+)；②广泛BM(?)；③血管周围脑间质裂隙内(?)。

    1.4  统计学方法

    数据采用SPSS10.0软件进行统计学分析。同侧大脑皮质、对侧大脑皮质和对照组大脑皮质三部位血管对La3+渗出之间的比较采用成组设计两样本比较的秩和检验，P<0.05为差别具有显著性意义。

    2  结果

    实验组同侧大脑半球脑组织可见高密度的La3+通过BMECs之TJs，主要分布在毛细血管的内皮下层，并通过BM广泛到达血管周围脑间质裂隙内，管腔内残留La3+附着于血管壁，BMECs胞浆内无La3+。对侧大脑半球脑组织局部可见La3+渗出至BM，但未发现血管外脑间质裂隙内La3+；对照组脑组织BMECs之TJs完整，管腔内La3+密集排列，管腔外无La3+（见图1～图4）。经成组设计两样本比较的秩和检验，实验组同侧大脑半球脑组织>实验组对侧大脑半球脑组织>对照组大脑半球脑组织（P<0.05）（见表1）。表1  硝酸镧示踪电镜观察BBB开放

    3  讨论

    正常脑血管内皮细胞膜结构为致密的脂质双分子结构，膜上有14 A°～18 A°的微孔，分子直径大于18 A°的物质不易透过BBB入脑，脑BBB的结构对维持脑内环境稳定起着重要作用［２，３］。临床上已应用甘露醇破坏BBB，增加化疗药转运脑肿瘤［４，５］。但目前关于渗透性开放BBB的途径与机制尚存争议。有学者认为是闭锁小带分离、细胞间TJs增宽所致，其机制涉及高渗透压诱导BMECs皱缩、血管舒张，以及影响第二信使系统—细胞内Ca2+引发细胞骨架和TJP收缩状态的改变，这种细胞骨架和第二信使系统的变化可能与BBB的短暂可逆性开放有关。但也有学者认为渗透性开放BBB包括TJs开放和胞饮作用增强。

    镧作为超微结构水平常用的示踪物，是一种高电子密度的重金属。硝酸镧分子量433，其颗粒平均大小约40埃，可进入除TJs外的细胞连接，且在细胞膜通透性正常时只存在细胞外间隙而不能进入细胞内，故常用于判断组织细胞间是否存在TJs屏障功能及细胞膜通透性改变的研究。

    本研究通过颈内动脉注射20%甘露醇开放SD大鼠BBB，采用外源性硝酸镧示踪透射电镜法对微血管超微结构和屏障功能改变进行深入观察，结果表明：颈内动脉注射20%甘露醇可诱导BBB通透性增加，屏障功能损害，实验组从毛细血管TJs管腔侧-BM-血管周围脑组织间质裂隙存在连续La3+沉积；而对照组脑组织BBB完整，La3+均匀附着于血管腔内，没有La3+渗出，表明La3+本身不影响BBB。同时我们发现各部位脑血管内皮细胞胞浆内均无La3+。说明La3+可能不是经胞饮作用穿行BMECs，而是经细胞侧隙途径，即BBB的TJs渗出到血管外。血管TJs开放程度与La3+渗漏密切相关，微血管超微结构损害愈重，TJs开放越显著，血管基膜外乃至组织间隙内La3+分布越广泛。对于对侧大脑半球脑组织存在轻度La3+渗出，表明甘露醇的BBB开放范围为整个大脑半球，对侧由于Willis环亦可有少许作用。据此，我们认为颈内动脉注射20%甘露醇诱导的BBB通透性增高与TJs开放密切相关，TJs是保持BBB完整性的重要因素。

    当然，目前研究表明：甘露醇开放BBB尚存在一时间窗的问题。Rapoport［６］等实验证实：大鼠BBB在注射高渗性甘露醇后15 min内开放程度最大，此后迅速下降，2 h内复原。Siegal等［７］采用99mTcGH的SPECT法研究人脑肿瘤表明：渗透性开放BBB对小分子物质的关闭时间比早先估计者延迟，渗透压破坏后最初40 min内BBB广泛开放，6 h～8 h后复原，这就界定了BBB不完全恢复的敏感时段，即治疗的时间窗。

    研究肿瘤及肿瘤周围脑组织TJs通透性的调节在脑胶质瘤综合治疗中具有深远意义，通过调节BMECs之TJs开放联合化疗可增进目前脑肿瘤化疗的效果。　

【】
  　　［１］ Tooru Inoue, Masashi Fukui, Shunji Nishio,et al.Hyperosmotic blood-brain barrier disruption in brains of rats with intracerebrally transplanted RG-C6 tumor. J Neurosurg,1987,66:256～263．

［２］ Bradbury MWB. The structure and function of the blood-brain barrier. Fed Proc,1984,43:186．

［３］ Bradbury MWB. The blood-brain barrier, transport across the cerebral endothelium. Cir Res,1985,57:213．

［４］ Doolittle ND, Miner ME, HallWA,et al.Safety and efficacy of a multicenter study using ntraarterial chemotherapy in conjunction with osmotic opening of the blood-brain barrier for the treatment of patients with malignant brain tumors. Cancer，2000，88(3):637～647.

［５］ Pan GY, Liu XD. Intracarotid infusion of hypertonic mannitol changes permeability of blood-brain barrier to methotrexate in rats ［Ｊ］.Acta Pharmacol Sin, 2000， 21: 613～614.

［６］ Rapoport SI, Robinson PJ. Size selectivity of blood-brain barrier permeability at various times after osmotic opening ［Ｊ］.Am J physiol, 1999，219:217～214

［７］ Siegal T, Rubinstein R, Bokstein F,et al.In vivo assessment of the window of barrier opening after osmotic blood-brain barrier disruption in humans. J Neurosurg，2000，92(4):599～605．