结扎兔基底动脉后脑干缺血范围的研究

              作者：张翠英 卢彦珍　范毅敏 王黎敏 尚改萍  

【摘要】  　　目的：观察结扎兔基底动脉后脑干的缺血范围。方法：在基底动脉起始部结扎制作脑干局部缺血动物模型，应用墨汁加明胶灌注并显示血管，光镜下分析延髓血管密度变化以确定缺血范围和程度，用尼氏染色观察神经元形态学变化。结果：结扎基底动脉后，脑干血管密度减少(P＜0.05)，范围为闩后0.2 mm～闩前10 mm，包括延髓上部和脑桥；尼氏染色显示缺血区一些神经元胞体肿胀，着色变浅，尼氏体减少，其灰度值明显高于对照组(P＜0.05)。结论：结扎基底动脉起始部可以引起延髓上部和脑桥的局灶性缺血性损伤。

【关键词】  基底动脉 脑干 缺血 兔

    Abstract  Objective：To observe ischemic coverage of brain stem after ligating basilar artery trunk in rabbits.Methods：Brainstem ischemic model were made by ligating the beginings of the basilar artery trunk, the blood vessels were perfused and showed with prepared Chinese ink and gelatin. the changes in the density of blood vessels were investigated for defining coverage and degree of ischemia. The morphology of neurons in brainstem were defined with Nissl stain.Results：The  density of blood vessels notably decreased in brainstem from 10 mm rostral to the obex to 0.2 mm posterior to the obex including pons and part of superior medulla.The soma was swollen and the Nissl bodies decreased in some of neurons in the ischemic region of brainstem. Conclusion：ligating the basilar artery trunk might induce pons and part of superior medulla focal ischemic damage.

    Key words  Basilar Artery;Brainstem;Ischemia;Rabbit

    临床上脑梗死多发于大脑动脉某一分支，尤其是大脑中动脉和椎基底动脉。脑干血供复杂,解剖部位较深,建立脑干缺血模型相对困难，因此目前这方面的研究主要集中在颈内动脉系统，而对椎基底动脉系统的研究较少。脑干中存在着维持生命活动的基本中枢，如呼吸中枢和心血管中枢等，脑干受损可直接威胁生命。我们前期的研究［１］表明结扎兔基底动脉主干后呼吸功能发生明显变化，为了进一步探讨这些功能改变的机制，本研究观察了结扎兔基底动脉主干后脑干的血供变化和神经元形态学改变。

    1  材料和方法

    1.1  实验动物分组与脑干缺血模型的制备

    实验选用健康大耳白兔（太行制药厂动物中心提供）12只，体质量2.3 kg～2.6 kg，雌雄不限，随机分为手术对照组（5只）和实验组（7只）。动物用25%氨基甲酸乙酯（4 mL/kg）耳缘静脉注射麻醉，仰卧位固定，行气管插管，在气管插管上方分离气管和食管，双结扎，于两结扎点之间切断气管和食管；分离肌肉组织，于枕骨基底部正中开一约2.0 cm×1.5 cm的骨窗，打开硬脑膜，暴露基底动脉及其分支，小心分离血管。手术对照组不结扎血管，实验组于基底动脉起始处结扎血管，实验过程中动物直肠温度维持在(37±0.5) ℃。

    1.2  动物的灌注、固定及组织学处理

    动物在结扎血管后6 h经左心室做升主动脉插管，灌注40 ℃～５０ ℃色胶400 mL（4%多聚甲醛、20%墨汁、1%明胶、75% 0.1 mol/L磷酸缓冲液，pH=7.4）［２］。次日取脑干置于10%甲醛溶液中固定1 W，20%蔗糖磷酸缓冲液中过夜下沉，冰冻切片机（Leica，CM 1850）恒冷箱内连续冠状切片，切片范围为闩后1 mm～闩前10 mm，片厚包括40 μm和7 μm两套，每连续切5张40 μm后切一张7 μm，40 μm的切片按顺序每5张取一张，用于观察血管密度和缺血范围，7 μm的切片按顺序全部取做尼氏染色以观察神经元形态学变化。

    1.３  缺血范围的判断

    采用BI-2000图像分析系统（成都泰盟科技公司出品）中免疫组化分析软件分析血管分布密度，具体方法是在每张切片中选定互不重叠的四个测量区域，区域内墨汁黑染的血管用一定的灰度值选定作为目标，自动测量，软件将自动求出测量区域内的血管分布密度、区域面积等结果。采用同样的软件观察尼氏染色切片中神经元的形态学变化，自动测量选定区域内的平均灰度值，所测灰度值从0级到255级，黑色为0，白色为255级，灰度值与神经元尼氏体的量成反比关系，灰度值越大，尼氏体含量越少。用血管密度变化和神经元的形态学变化作为缺血的判定指标。

    1.４  统计学处理

    同一组动物的脑干血管密度和神经元灰度值分别取平均值，用均数±标准差（x±s）表示。两组动物的血管密度和神经元灰度值采用EXCEL中两样本均数F检验比较。

    2  结果

    两组动物脑干中未见没有血管分布的区域,但实验组血管密度减少,测得实验组和对照组的血管分布密度分别为0.161±0.02和0.76±0.03，两组之间呈显著性差异(见图1A和B，P＜0.05）；矢状轴上的缺血范围从闩后0.2 mm至闩前10 mm，包括延髓上部和脑桥。实验组脑干中一些神经元胞体肿大，尼氏体减少，染色浅染（见图1C和D），实验组和对照组神经元的平均灰度值分别为197.35±3.87和119.29±8.61，两组间有显著性差异（P<0.05）。

    3  讨论

    3.1  结扎基底动脉起始部对脑干血供的影响

    脑干缺血模型建立对于脑干缺血性损伤的病理、病理生理及药的研究具有重要意义，但国内外学者对此模型的研究较少，各人所用方法和所选动物也不尽相同［３～6］。本实验中，我们选用家兔为实验对象，动物来源较丰富，价格较低廉，脑循环的解剖结构与大鼠、小鼠及人类相似，而且动物体积大，手术易于操作，提高了制作模型的成功率；基底动脉起始部单点结扎，由于未阻断Willis环对延髓的侧支供血，与临床椎基底动脉供血障碍非常接近。墨汁加明胶能使脑干中血管在切片中明确显示，根据切片中血管密度及尼氏染色中神经元尼氏体的着色深浅和形态变化确定是否缺血及缺血的范围，结果表明这一方法建立的模型更适用于研究椎基底动脉供血障碍时各种功能的改变及措施的综合效果。在实验组和对照组中，脑干未见到完全没有灌注血管的区域，但实验组在延髓上部及脑桥有血管密度的减少，说明脑干血管之间存在丰富的吻合支，这对于脑局灶性缺血时对基本生命中枢的保护具有重要意义。此结果与张信等［７］在大鼠、庄旭等［２］在猫的研究结果一致。延髓下部血管密度无显著变化，表明闩后区域的主要血供并不来自基底动脉，推测可能来自小脑后下动脉及椎动脉发出的分支。

    3.2  神经元形态学变化

    神经元的结构特征之一是含有大量尼氏体，其主要功能是合成细胞器及与神经递质和酶有关的蛋白质，由粗面内质网及其间的游离核糖体组成。本实验中观察到缺血区域内一些神经元胞体肿胀，尼氏体浅染，灰度值增大，表明神经元内尼氏体减少，神经元合成蛋白的功能下降，这可能是缺血后机体功能活动异常的结构基础。缺血期间神经元受损可能由于①神经毒性物质（如兴奋性氨基酸、GABA、5-HT、腺苷等）堆积。例如缺血时突触部位谷氨酸释放增加而摄取减少，过量的谷氨酸可激活多种谷氨酸受体，使K+外流，Na+和Ca2+内流，Na+内流使水进入细胞进而导致水肿；Ca2+内流可激活多种有害的Ca2+依赖性信号通路；②缺氧时ATP含量减少，线粒体不能进行氧化磷酸化，乳酸堆积；ATP含量减少也可激活神经元的ATP敏感性钾通道（KATP），使神经元膜电位超极化；③缺氧时还可产生氧自由基，对质膜、细胞器等破坏［８］。

【】
  　　［１］ 张翠英，卢彦珍，范毅敏，等. 结扎兔基底动脉后对呼吸和血压的影响. 长治医学院学报，2007，21（5）：321～323．

［２］ 庄 旭，郭俊霞，张承武，等. 阻断猫基底动脉引起的延髓缺血和呼吸血压效应的研究.应用生理学杂志，2003，１9（4）：323～327．

［３］ Yamada K, Hayakawa T, Yoshimine T，et al. A new model of transient hindbrain ischemia in gerbils. J Neurosurg,1984，60:1　054～1　058．

［４］ Shiroyama Y, Nagamitsu T, Yamashita T，et al.Changes in brain stem blood flow under various grades of brain stem ischemia. Tohoko J Exp Med,1991，164:237～246．

［５］ Nakahara T, Oki S, Muttaqin Z，et al. A new model of brainstem ischemia by embolization technique in cats. Neurosurg Rev, 1991，14:221～229．

［６］ 李学佩，马芙蓉，王 伟，等.椎基底动脉脑缺血动物模型.北京医科大学学报，1995，27（6）：427～429．

［７］ 张 信，张彦学，宫学华，等.大鼠基底动脉闭塞所致神经症状及缺血范围观察. 脑与神经疾病杂志，2005，17（2）：14～1６．

［８］ Daniel Zemke, Jeremy L. Smith, Mathew J.reeves, etc.Ischemia and Ischemia Tolerance in the Brain. Int J Cerebrovasc Dis，2006，14(3):190～196.