桥本甲状腺炎甲状腺组织TRAIL、Caspase?3的表达
【摘要】 目的研究桥本甲状腺炎（HT）患者甲状腺组织中肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶?3（caspase?3）的表达及其在HT发病和病理改变中的意义。方法采用S?P免疫组织化学方法检测26例HT（HT组）和12例正常甲状腺组织（对照组）中TRAIL、caspase?3的表达情况。结果（1）TRAIL、caspase?3在HT组呈高表达，多见于浸润淋巴细胞旁的甲状腺滤泡上皮细胞；而浸润的淋巴细胞TRAIL染色阴性，caspase?3染色呈弱阳性。（2）TRAIL的表达阳性率在HT组明显高于对照组(72.92% vs 41.67%，P<0.05)，前者滤泡上皮细胞的表达强度明显高于后者/[（0.051±0.016） vs （0.016±0.010），P<0.05/]。(3)caspase?3的表达阳性率在HT组明显高于对照组(92.31% vs 33.33%，P<0.01)，滤泡上皮细胞的表达强度明显高于对照组/[（0.065±0.025）vs（0.022±0.008），P<0.05/]。(4)TRAIL与caspase?3的表达程度呈正相关 (rs=0.631，P=0.001)。 结论TRAIL与caspase?3可能共同参与HT的病理演变过程，通过表达TRAIL激活caspase?3而诱导甲状腺滤泡细胞凋亡，损伤甲状腺组织。
【关键词】 肿瘤坏死因子 胱氨酸天冬氨酸蛋白酶
桥本甲状腺炎（Hashimoto’s thyroiditis，HT）是器官特异性自身免疫性疾病，以免疫活性细胞浸润、甲状腺特异性自身抗体和甲状腺自身抗原特异性T淋巴细胞存在以及滤泡结构的破坏为特征，是引起甲状腺功能减退症的最常见原因，其发病机制尚不清楚。研究表明细胞凋亡在HT的发病机制中起重要作用[1]。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL，Apo?2L)为肿瘤坏死因子超家族（TNFRSF）的成员，是一个新近发现的与FasL同源的死亡配体，与死亡受体DR4、DR5结合诱导细胞凋亡。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶?3（caspase?3）则是细胞凋亡重要的效应分子，活化DNA酶，降解染色体，最终引起细胞凋亡。笔者通过免疫组织化学方法，检测HT患者甲状腺组织中TRAIL、caspase?3的表达，探讨TRAIL、caspase?3在HT发病机制及病理改变中的意义。
1对象与方法
1.1对象选取2001?2005年手术切除并经病理确诊为HT的甲状腺组织标本26例（HT组），男性3例，女性23例，中位年龄44.5岁（27～63岁）。选择2004?2005年住院甲状腺腺瘤患者腺瘤旁正常组织12例（对照组），男性1例,女性11例,中位年龄32岁（20～68岁）。2组患者术前均未接受药物及同位素。
1.2方法鼠抗人TRAIL单克隆抗体（美国R&D公司）；鼠抗人caspase?3单克隆抗体（美国LAB VISION公司）；免疫组织化学试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司）。采用S?P免疫组织化学染色方法检测TRAIL、caspase?3，操作按说明书进行。用已知阳性片作为阳性对照，同时用PBS替代第一抗体作阴性对照。
1.3结果判断与图像分析阳性染色细胞质呈棕黄色。根据细胞质的染色强度逐渐加深进行评分，分为1,2,3分；根据着色细胞百分率进行评分，分为1，2，3，4分。将每张切片染色强度得分与着色细胞百分率得分各自相乘为其最后得分：0分为阴性（－），1～2分为弱阳性（＋），3～4分为中等阳性（?），≥6分为强阳性（?）。
采用图像分析系统（CMIAS?B型，北京航空航天大学图像中心、空军总）测定阳性甲状腺滤泡上皮细胞的TRAIL、caspase?3的平均光密度（D）值，即阳性细胞质单位面积内TRAIL、caspase?3的相对含量，单位为AU (arbitrary units)。
1.4统计学处理应用SPSS 11.0统计软件包进行分析。两样本率差别检验用四格表Fisher确切概率法；所得定量资料采用t检验，方差不齐时行t＇检验；变量之间相关关系的比较，采用非参数统计中的等级资料Spearman秩相关作数据分析。P＜0.05为界值。
2结果
2.1免疫组织化学染色
2.1.1TRAIL染色HT组阳性细胞分布不均匀，强阳性细胞多集中在淋巴滤泡和生发中心附近的甲状腺滤泡上皮细胞，部分甲状腺滤泡已萎缩、破坏，失去滤泡结构，滤泡内无胶质；另一部分甲状腺滤泡结构完整，阳性染色上皮细胞多为立方状或低柱状，HT中浸润淋巴细胞TRAIL不染色。对照组中TRAIL仅见于少数甲状腺滤泡上皮细胞（图1）。HT组与对照组TRAIL阳性表达率比较见表1。
A：对照组阳性细胞仅见于少数甲状腺滤泡上皮细胞; B：桥本甲状腺炎组阳性细胞集中在浸润淋巴细胞附近的甲状腺滤泡上皮细胞，浸润淋巴细胞阴性.
图1甲状腺组织的TRAIL免疫染色阳性（S?P×400）
Fig 1Immunostained TRAIL in the thyroid tissues of HT and control（S?P×400）
2.1.2Caspase?3染色HT组中，caspase?3阳性多见，强阳性细胞主要分布在浸润淋巴细胞形成的淋巴滤泡及其附近的滤泡上皮细胞，部分甲状腺滤泡萎缩、破坏，滤泡结构消失，滤泡内无胶质；另一部分甲状腺滤泡结构尚完整，阳性细胞多为立方状或低柱状。浸润淋巴细胞呈弱阳性表达，淋巴滤泡的染色呈“向心型”，中间生发中心染色较深，外周淋巴细胞染色较浅。对照组中，caspase?3阳性染色细胞多见于甲状腺滤泡上皮细胞，多为扁平状，且分布不均（图2）。HT组与对照组阳性率比较见表2。
A:对照组阳性细胞主要是甲状腺滤泡上皮细胞，分布不均; B: 桥本甲状腺炎组强阳性染色集中在浸润淋巴细胞附近的甲状腺滤泡上皮细胞,浸润淋巴细胞染色弱阳性. 表 1TRAIL在甲状腺滤泡上皮细胞的表达表2caspase?3在甲状腺滤泡上皮细胞的表达表中数据为例数（%）.caspase?3:天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶?3;HT:桥本甲状腺炎.与对照组比较,☆☆:P<0.01.
2.2TRAIL与caspase?3表达强度HT组与对照组TRAIL、caspase?3比较见表3。
2.4TRAIL与caspase?3表达的相互关系HT组，TRAIL及caspase?3表达存在一定的平衡关系，即TRAIL蛋白表达强的病例caspase?3一般表达也较强。TRAIL与caspase?3表达呈正相关关系（r =0.631，P<0.01）；而对照组无相关关系（r=0.290，P>0.05）。表3对照组和HT组TRAIL、caspase?3的表达强度TRAIL:肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体;caspase?3天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶?3;HT:桥本甲状腺炎.与对照组比较，☆:P<0.05.
3讨论
以往研究显示，HT甲状腺组织中凋亡相关基因Fas及其配体Fasl的表达明显增高[1]。TRAIL与肿瘤坏死因子（TNF）和FasL同属TNF超家族的成员，在机体的免疫调节、肿瘤细胞凋亡及维持机体组织细胞稳定方面起重要的作用。TRAIL和它的死亡受体TRAIL?R1(亦称DR4)和/或TRAIL?R2(亦称DR5)相互作用可通过死亡结构域激发和传导凋亡信号，诱导细胞发生凋亡。TRAIL在甲状腺炎发病中的作用日渐引起人们的注意，Bretz等认为TRAIL比FasL在自身免疫性甲状腺疾病中所起的作用更为重要[2]。
本研究显示，HT组TRAIL与对照组比较呈高表达，TRAIL阳性的甲状腺滤泡上皮细胞多分布在淋巴细胞及淋巴细胞形成的淋巴滤泡附近，而淋巴细胞不表达TRAIL，提示TRAIL可能参与HT的发病和病理改变过程。浸润淋巴细胞不表达TRAIL，有可能是机体为保护自身免受活化诱导的细胞杀伤作用而逃避外周克隆清除和活化的淋巴细胞清除作用，这是形态上甲状腺组织中大量淋巴细胞浸润、淋巴滤泡形成的原因之一。Ehrlich等研究表明，活性T淋巴细胞表达TRAIL并对TRAIL诱导的细胞凋亡敏感，认为TRAIL及其受体在维持免疫系统对自身抗原的免疫耐受和组织自身稳定中起重要作用，而自身免疫性甲状腺炎的活性T淋巴细胞亦有可能表达TRAIL并介导细胞凋亡导致甲状腺组织破坏[3]。本研究与上述研究结果不同，提示不同的淋巴细胞系及末梢T淋巴细胞对TRAIL诱导的凋亡敏感性不同。显示，正常甲状腺细胞内抵抗TRAIL诱导的细胞凋亡的保护机制，与存在2个诱骗受体TRAIL?R3和TRAIL?R4有关，诱骗受体与TRAIL?R1、?R2竞争性结合TRAIL阻止了凋亡信号传导[4]。此外，在不同的组织中，通过TRAIL表达量的调节也可以使正常组织免受凋亡。Wang等发现，通过压抑PI?3激酶途径可以增加TRAIL表达量，而使细胞诱发凋亡[5]。因此，TRAIL表达量的调节对凋亡有着重要作用，正常表达可使正常组织免受凋亡。本研究显示正常甲状腺滤泡上皮细胞亦表达TRAIL，且表达量减少，可能与上述机制有关，提示正常甲状腺组织中可能存在低水平的细胞凋亡。
文献报道caspase家族在细胞凋亡中担任主要执行者的任务，通过阻止DNA修复，干扰DNA、RNA的拼接，使细胞成分降解并形成凋亡小体。在蛋白酶级联切割过程中，caspase?3处于核心位置[6]，因此caspase?3被称为死亡蛋白酶。本研究发现，HT组caspase?3的表达比对照组高，笔者认为caspase?3可能参与HT的发病和病理改变过程，参与甲状腺滤泡上皮细胞的凋亡。前述HT中大量淋巴细胞浸润提示可能存在抑制淋巴细胞凋亡的机制，而浸润淋巴细胞caspase?3弱阳性表达，推测caspase?3在浸润淋巴细胞中可能以无活性的酶原形式存在，由于各种抗凋亡因素存在而没有被激活，故抑制淋巴细胞发生凋亡。本研究中正常甲状腺滤泡上皮细胞caspase?3弱表达提示正常甲状腺组织中可能存在抗凋亡机制或低水平的细胞凋亡。
HT组TRAIL及caspase?3表达存在一定的平衡关系，TRAIL阳性表达的甲状腺滤泡细胞及caspase?3分布相似，多分布在淋巴细胞及淋巴细胞形成的淋巴滤泡附近，且甲状腺滤泡多已萎缩、破坏，滤泡结构消失，内无胶质，TRAIL蛋白表达强的病例中caspase?3一般表达也较强，二者呈正相关，提示TRAIL及caspase?3共同参与甲状腺滤泡细胞的破坏，参与HT的发病及病理过程。以往的研究表明，与TNF/NGR家族其他成员(如TNF，FasL)一样，TRAIL系统介导的凋亡需caspase信号途径参与[7?9]。甲状腺滤泡上皮细胞是否通过表达TRAIL，并与其死亡受体结合而启动细胞内一系列信号传导，激活caspase?3，介导滤泡上皮细胞发生凋亡有待进一步探讨。此外，研究中，对照组TRAIL及caspase?3表达无相关关系，提示caspase?3的活化可能并不完全取决于TRAIL的表达，是多种因素共同作用的结果。由于caspase?3处于caspase级联反应的下游区，TRAIL可能不直接作用于caspase?3，其间一系列信号传导途径仍有待进一步研究。
【文献】
/[1/]刘东晖，杨立勇，张声，等.Fas及其配体Fas在自身免疫性甲状腺疾病的表达/[J/]. 医学研究通讯, 2002,31:12?15.
/[2/]Bretz J D,Baker J D. Apoptosis and autoimmune thyroid disease: following a TRAIL to thyroid destruction/[J/]. Clin Dndocrinol, 2001,55:1?11.
/[3/]Ehrlich S,Infante?Duarte C,Seeger B,et al. Regulation of soluble and surface?bound TRAIL in human T cells, B cells, and monocytes/[J/]. Cytokine, 2003,24(6):244?253.
/[4/]Daniels R A,Turley H,Kimberley F C,et al. Expression of TRAIL and TRAIL receptors in normal and malignant tissues/[J/]. Cell Res, 2005,15(6):430?438.
/[5/]Wang Q,Wang X,Hernandez A,et al. Regulation of TRAIL expression by the phosphatidylinositol 3?kinase/Akt/GSK?3 pathway in human colon cancer cells/[J/]. J Biol Chem, 2002,277(39):36602?36610.
/[6/]Srinivasula S M,Saleh A,Ahmad M,et al. Isolation and assay of caspases/[J/]. Methods Cell Biol, 2001,66:1?27.
/[7/]Xu S Q,El?Deiry W S. P21 (WAF1/ CIP1) inhibits initiator caspase cleavage by TRAIL death receptor DR4/[J/]. Biophys Res Commun, 2000,269(1):1791.
/[8/]Hao C,Beguinot F,Condorelli G,et al. Induction and intracellular regulation of tumor necrosis factor?related apoptosis inducing ligand(TRAIL) mediated apoptosis in human malignant glioma cells/[J/]. Cancer Res, 2001,61(3):1162.
/[9/]Kim H S,Chang I,Kim J Y,et al. Caspase?mediated p65 cleavage promotes TRAIL?induced apoptosis/[J/]. Cancer Res, 2005,65(14):6111?6119.
