定量光导荧光技术评价含氟牙膏抑制早期龋损的效果

【摘要】  目的 通过在体外形成牙釉质光滑面早期龋损的恒化器龋病模型,评价定量光导荧光技术反映光滑面早期龋损矿物质含量变化的效果。 方法 将30个牙釉质块开窗后分为3组,分别使用氟含量1 450 mg/L的氟化钠牙膏、单氟磷酸钠牙膏和无氟牙膏的处理液处理,并在体外恒化器龋病模型中进行脱矿循环, 定量光导荧光技术(QLF)分析病损脱矿后的面积、荧光损失和总荧光损失量,激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)分析脱矿后矿物质含量变化。 结果 在体外恒化器龋病模型中,无氟组形成的病损面积较大,荧光损失量较高,总荧光损失量以10为底的对数值较大(P<0.05),氟化钠组和单氟磷酸钠组的差别无统计学意义(P>0.05);激光共聚焦显微镜观察显示,脱矿循环中无氟组形成的病损在荧光面积、平均荧光量和总荧光量3个参数上都明显高于其他两组,差别有统计学意义(P<0.05)。QLF分析与CLSM结果具有较好的相关性(r>0.70)。 结论 2种氟浓度1 450 mg/L的牙膏与无氟牙膏比较,具有明显的抑制牙釉质光滑面早期龋损脱矿的作用。QLF分析结果能够客观的反映脱矿病损区矿物质含量的变化。

【关键词】  氟; 牙膏; 龋齿; 牙釉质; 荧光; 显微镜检查,共焦

    ABSTRACT:  Objective  The objective of the study is to assess the effect of quantitative light-induced fluorescence(QLF) in monitoring demineralization of early caries on smooth surfaces by comparing it with confocal laser scanning microscope through bacteria models in vitro.  Methods  Enamel surface specimens were randomly allocated into 3 groups: 1 450 mg/L sodium fluoride dentifrice group, 1 450 mg/L sodium monofluorophosphate dentifrice group and non-fluoride dentifrice control group.  Sound enamel surfaces were dematerialized in bacteria model in vitro.  QLF was used to analyze the area of lesions(Area), the loss of fluorescence(ΔF) and ΔQ(Area×ΔF) on enamel surfaces after demineralization.  Confocal laser scanning microscopy(CLSM) was used to quantify the mineral content after demineralization.  Results  Area, ΔF and ΔQ in non-fluoride dentifrice group were significantly higher than other two fluoride groups after demineralization(P<0.05).  No statistical difference was found between two fluoride groups(P>0.05).  Results from CLSM supported that area of the fluorescent lesion, total fluorescence and average fluorescent of the lesion in non-fluoride dentifrice group were higher than other two groups after demineralization(P<0.05).  QLF and CLSM showed fine correlation after demineralization(r>0.70).  Conclusion  Sodium fluoride and sodium monofluorophosphate dentifrice(F 1.450 mg/L) in reversal of early caries were better than non-fluoride one.  The mineral changes in early caries lesions can be assayed by QLF in vitro.

    KEY WORDS:  fluoride; toothpaste; dental caries; dental enamel; fluorescence; microcopy,confocal
　　
    含氟牙膏是目前世界上使用最普遍也是最主要的局部用氟防龋的方法。目前我国市售的含氟牙膏中使用的氟化物一般为氟化钠(NaF)和单氟磷酸钠(MFP)。笔者通过在恒化器龋病模型中形成光滑面早期龋损,使用2种含不同氟化物的牙膏对其脱矿过程进行干预,并采用定量光导荧光技术(QLF)和激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察,评价QLF技术用于分析早期龋损矿物质含量变化的能力。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  实验菌株 

　　变形链球菌(Streptococcus mutans)ATCC 25175,由华西口腔医学院口腔生物医学工程重点实验室提供。

　　1.1.2  培养基 

　　TPY固体培养基(自配);BHI液体培养基(英国Oxoid公司)。
　　
　　1.1.3  主要设备 

　　八通道蠕动泵及分配器(BT00-600M型,保定兰格恒流泵有限公司);循环水浴箱(HX-1050型,北京博医康技术公司);磁力加热搅拌器(CJJ-781型,江苏金坛振兴仪器厂);硬组织切片机(丹麦Struers公司);CLSM(TCS-SP2型,德国Leica公司);QLF系统(荷兰Inspektor公司)。

　　1.1.4  主要试剂

　　人工唾液:采用人工唾液配方为生物膜改良培养基BM-5［1］:2.50 g/L Ⅱ型猪胃黏蛋白(TypeⅡ,美国Sigma公司);2.00 g/L肽胨、1.00 g/L胰酶分解的酪蛋白胨(美国Fluka公司);1.00 g/L酵母提取物(英国Oxoid公司);0.10 g/L半胱氨酸盐酸盐(美国Sigma公司);2.50 g/L氯化钾;0.50g/L葡萄糖;0.114 g/L磷酸氢二钾;0.20 g/L磷酸二氢钾;8.5 g/L蔗糖。以1 mol/L NaOH溶液调整pH值至 7.5,121 ℃,15 Pa压力下灭菌15 min。

    含氟牙膏处理液:无氟、含NaF、含MFP的牙膏(氟含量均为1 450 mg/L)分别与去离子水按1∶4混合均匀。

　　1.2  方法

　　1.2.1  釉质块制备 

　　收集新鲜拔除的人类无龋双尖牙15颗,在体视显微镜下观察无龋损、裂纹、缺损和釉质白斑。分离冠根,去除牙冠表面大约100 μm的表层釉质,并使之成为光滑的平面。用硬组织切片机将预备好的牙冠分为颊、舌两部分。在每个牙体组织块的釉质表面用指甲油开窗,面积3 mm×3 mm。将上述组织块随机分为3组,每组10个样本,在龋病恒化器模型中分别采用无氟、含NaF和含MFP的处理液进行干预。

　　1.2.2  模型设计 

　　将组织块置于含定量实验菌株的连续培养系统中,维持培养室内一定的循环流速模拟口内唾液的冲刷作用,在体外环境下模拟光滑面早期龋损的形成［2］。变形链球菌经复苏、传代、生化鉴定后接种到恒化器模型,由蠕动泵分配进入连续培养室中,同时按菌液与新鲜培养基1∶9(v/v)比例给予新鲜的人工唾液。24 h后停止接种细菌,继续给予新鲜人工唾液。细菌生长达到稳定后,将含NaF、MFP和无氟的处理液分别间断加入连续培养室中,每天3次,每次1 h,由蠕动泵控制,连续5 d至实验终止。体外恒化器模型见图1。

　　1.2.3  牙体组织病变形成观察和分析 

　　样本经丙酮清洗,丙烯酸树脂包埋,露出开窗区。0.55 MPa压缩空气吹干标本30 s,拍摄标本的荧光图像,储存于电脑,QLF200 g软件分析图像,分析过程采用盲法,设置ΔQ(荧光损失量)值变化5%为病损阈值。硬组织切片机将牙齿标本切成约300 μm厚的牙片,37 ℃、新鲜配制的罗丹明B(0.1 mmol/L)染色1 h,吹干,中性甘油封固,CLSM观察牙体组织的荧光激发情况。

　　1.3  统计学处理 

　　分析QLF200 g软件和Laser pix软件得出3组病损的荧光面积、荧光损失和总荧光损失量的差异,QLF分析结果与CLSM参数的相关性,评价QLF的诊断效能。设检验水准α＝0.05。由于ΔQ的分布呈明显的偏态分布,统计时将其进行以10为底的对数转换。

　　2  结  果

　　2.1  肉眼观察 

　　无氟组釉质表面的开窗区失去光泽,呈现白垩色病变,涂布指甲油区域釉质表面有光泽,未见颜色或形态的改变;另外两组样本釉质表面开窗区和涂布指甲油的区域釉质未见明显的颜色或形态改变。

　　2.2  QLF荧光照片及结果分析 

　　连续培养5 d后,3组牙釉质块表面在体外恒化器龋病模型中均形成不同程度的脱矿病损,在QLF荧光照片中表现为病损区荧光强度的丧失(图2)。无氟组牙釉质表面形成的病损面积较大,荧光损失较严重。在体外恒化器龋病模型中,3组标本表面均形成了不同程度的早期龋病损。其中无氟组病损与其他两组比较,病损面积较大,荧光损失值较高,总荧光损失量的对数值较大。3组差别有统计学意义,但NaF和MFP组差别无统计学意义(P>0.05,表1)。表1  3组病损面积、平均荧光损失和LgΔQ值（略）

　　2.3  CLSM观察及软件分析

　　NaF组和MFP组在体外模型中形成的病损经罗丹明B染色后激发的荧光强度较无氟组明显较弱,荧光范围也明显较无氟组小(图3)。

    无氟组形成病损在荧光面积、平均荧光量和总荧光量3个参数上都明显高于其他2组,差别有统计学意义,而NaF组和MFP组在荧光面积、平均荧光量和总荧光量3个方面的差别无统计学意义(P>0.05,表2)。表2  3组在模型中形成的脱矿病损的CLSM测量参数（略）

　　2.4  QLF与CLSM结果的相关性分析 

　　分析QLF结果中Area、ΔF和ΔG与Laser pix软件分析CLSM结果中A、AF和TF的相关性,Pearson相关系数分别为0.73,0.79和0.81。

　　3  讨  论

　　3.1  恒化器龋病模型的优点
 
　　恒化器模型能在体外形成一种与体内近似的口腔生态环境,调控细菌的生长代谢条件,使之既具有与天然环境的一致性,又具有标准化和可调控性的显著优点［3］，不仅可用于研究各种致龋因素的作用和龋病病变的特征,还可用于鉴定防龋药物的效能。黄正蔚等利用与本实验类似的恒化器模型在体外环境中形成了相似于釉质龋损的病变,并充分证明了该模型的稳定性和重复性［4］。

　　3.2  QLF及其优势
 
　　QLF是近年来国际上研究开发的一种诊断早期龋损的便携式技术设备,其技术基础源于荧光技术。牙体组织在单色光的照射下能够被激发出不同光谱的荧光,而正常牙体组织和早期脱矿牙体组织在诱导荧光强度方面存在着较大的差异［5］。在QLF荧光照片中,正常的釉质表现为高亮度的黄绿色荧光,而包括龋损区在内的脱矿区域则表现为明显的暗区。牙体脱矿越明显,则该区发出的荧光强度越弱,其相关系数r=0.73~0.86［6］。

    目前能够对光滑面早期龋损矿物质含量进行定量或半定量的方法有偏光显微镜法、显微硬度法、激光扫描共聚焦显微镜法和横断显微放射照相技术等［7-8］。虽然这些方法都可以较为准确的对矿物质的损失量进行定量,但是都要求制备标本,然后用特殊的仪器进行观察,因此只能在体外试验或者原位实验中才能实现。对于口腔内的天然病损来说,则需要象QLF这种无创并能够对病损区矿物质含量进行纵向监测的技术。

　　3.3  QLF用于评价含氟牙膏抑制早期龋的效果 

　　在本研究中,3组牙釉质块开窗区在体外恒化器模型中均形成一定程度的光滑面早期龋损,但3个处理组形成病损的严重程度不一。在QLF,CLSM的荧光图像中均表现为无氟牙膏组形成的病损明显较含氟牙膏组形成的病损严重,说明氟含量为1 450 mg/L的含氟牙膏的干预有较为明显的抑制模型中光滑面早期龋损形成的作用。而含不同氟化物的两组在模型中形成的病损在病损面积和荧光损失量的差别无统计学意义,说明这两种含氟浓度相同的牙膏抑制光滑面早期龋损方面的作用是相似的。

    本研究还表明,病损区的QLF分析结果和CLSM分析结果之间具有较好的相关性(r>0.70)。QLF能对病损区矿物质含量变化进行定量诊断,而且具有无创的优点,可以将其作为诊断手段用于监测人群中光滑面早期龋损矿物质含量的变化。

【】
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　　［4］黄正蔚,周学东,李继遥,等. 口腔生物膜体外模型的建立及应用评估［J］. 牙体牙髓牙周病学杂志, 2004,14(9):481-484.

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