人突变型低氧诱导因子1α对大鼠后肢缺血模型血管新生的影响

【摘要】  目的： 探讨564与402双位点突变的HIF?1α基因(Ad?HIF?1α?564Ala?402Ala, 简称Ad?H564/402）在大鼠下肢急性缺血模型中的表达及对血管新生的影响. 方法： ①将先期构建的Ad?H564/402在HEK293A细胞中进行扩增，用氯化铯浓度梯度离心法进行腺病毒纯化. 用显微镜、PCR及测序的方法鉴定并用分光光度计法测定病毒滴度；②构建急性大鼠下肢缺血模型，随机分为4组，分别以Ad?LacZ, Ad?H0, Ad?H564/402和生理盐水（NS）转染术侧下肢骨骼肌，于转染后1, 3, 5, 7 d，应用RT?PCR测定骨骼肌中HIF?1α mRNA的表达量；③基因转染后28 d，选择性下肢动脉造影及血管铸型观察血管密度. 结果： ①经扩增、纯化后基因突变区信息保存完好，最终滴度达到（6.29±0.26）×1014 OPU（optical particle unit,光学颗粒单位）/L. ②突变体基因Ad?H564/402的相对表达量高于野生型HIF?1α基因（P=0.000）；且以第7日最高（P=0.000）；经两两比较，不同基因组间及不同转染天数间的表达量均有显著的统计学差异（P=0.000）. ③基因转染28 d后造影及血管铸型结果显示：Ad?H564/402组的绒毛小血管数大于Ad?H0组及其他各组. 结论： ①外源性突变体Ad?H564/402基因可促进体内HIF?1α mRNA的表达. ②外源性突变体Ad?H564/402基因可促进缺血骨骼肌的侧支血管形成及微血管新生. ③突变体Ad?H564/402基因的生物学功能较野生型基因Ad?H0更强.

【关键词】  低氧诱导因子1 血管生成 逆转录聚合酶链反应 动脉造影

　　0引言

　　人低氧诱导因子?1(hypoxia inducible factor 1, HIF?1)是应答细胞氧张力变化的基因表达的重要调节因子［1］，由两个亚单位组成，即氧调节亚单位HIF?1α和构成性表达的亚单位HIF?1β［2］. HIF?1α可调控下游60多种与血管生长、血管张力、糖代谢、红细胞生成及干细胞诱导分化等相关的基因，包括血管内皮生长因子(VEGF)及其受体（Flt?1），神经纤毛蛋白?1（Neuropilin?1）, 血管生成素(Ang)?1, ?2, ?4, 血小板衍生生长因子（PDGF）和胎盘生长因子(PIGF)中的其他成员［3］. 由于其独特的结构，HIF?1α只有在低氧条件下才能发挥功能，其蛋白形式在常氧下5 min即发生降解. 我们先期对HIF?1α的关键位点进行了定点突变，并将其成功包装腺病毒［4-5］. 我们将其应用于大鼠下肢急性缺血模型中，观察其对血管新生的影响.

　　1材料和方法

　　1.1材料564与402双位点突变的人低氧诱导因子1α(Ad?HIF?1α?564Ala?402Ala,简称Ad?H564/402)、野生型人低氧诱导因子1α(简称Ad?H0)及β?半乳糖苷酶(β?galactosidase)基因(简称Ad?LacZ)，均由本课题组构建. RNAiso Reagent(TaKaRa 公司), Taq DNA 聚合酶(TaKaRa 公司)，含碘3.5×105g/L的欧乃派克TM（上海安盛药业有限公司），PT?PCR仪（FTC?2000，上海），NSX?6000型数字血管X射线摄影装置（Neusoft公司生产）. HIF?1α 上游引物：5′?TCGACACAGCC TGGATATGA?3′；下游引物：5′?CGGCTGCGGCCAGCAAAGTT?3′. GAPDH上游引物：5′?ACCACAGTCCATGCCATCAC?3′；下游引物：5′?TCCACCACCCTGTTGCTGTA?3′. 由上海生物工程公司合成. 清洁级雄性Wistar大鼠72只，10～12 wk龄，体质量(230±20)g. 由河南医科大学实验动物中心提供［许可证号：SCXK(豫)?2005?0001］.

　　1.2方法

　　1.2.1各组基因腺病毒载体的扩增、纯化及滴度测定在HEK293A细胞中大量扩增腺病毒，氯化铯密度梯度离心法纯化，通过PCR及基因测序鉴定病毒,分光光度计法测定病毒滴度.

　　1.2.2构建急性大鼠下肢缺血模型用100 mL/L水合氯醛按3～4 μL/g腹腔注射麻醉大鼠. 在严格无菌条件下暴露左侧后肢股动脉起始端及其分支，以细手术线结扎并离断股动脉，造成急性后肢缺血模型. 假手术组大鼠麻醉后仅切开皮肤再缝合，不处理血管.

　　1.2.3动物分组与基因转染将模型大鼠随机分4组，每组18只，造模后即刻沿血管走向分5个位点（内侧3点、外侧2点）局部肌肉内注射基因：Ad?H564/402，Ad?H0，Ad?LacZ，滴度为1×1012 OPU/L，总体积为0.5 mL，对照组注射等量的生理盐水（NS）. 缝合皮肤，继续分笼喂养.

　　1.2.4RT? PCR测定骨骼肌中HIF?1α mRNA的表达于基因转染第1, 3, 5, 7 d，过量麻醉处死大鼠，取术侧下肢注射部位的骨骼肌快速液氮冰冻，取80 mg在液氮下研碎，用RNAiso Reagent 提取组织总RNA， 反转录合成cDNA，PCR扩增，条件为：95℃预变性5 s，95℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30个循环. 72℃ 5 min, 4℃备用. 用GAPDH基因作为内对照，RT?PCR测定HIF?1α mRNA的相对表达量.

　　1.2.5大鼠下肢动脉血管造影基因转染后第28日，麻醉大鼠后剖开腹腔，顺行穿刺腹主动脉，用稀释1倍的含碘3.5×105g/L欧乃派克行动脉造影，手推造影剂2～4 mL/次，以6幅/s的速度连续摄像记录. 以假手术组为阴性对照.

　　1.2.6大鼠下肢动脉血管铸型基因转染后第28日，过量麻醉处死大鼠，切开腹腔，暴露腹主动脉，顺行插管固定，分次灌注50 g/L，100 g/L的有色填充剂，充分凝固24～36 h后去皮，并用酸腐蚀法去除骨骼及肌肉组织，仅保留动脉. 以假手术组为阴性对照.

　　统计学处理： 用SPSS13.0进行数据分析. 计量资料以x±s表示，组间比较采用析因设计的方差分析，两两比较用LSD 检验，P<0.05 有统计学意义. 以目的基因（HIF?1α）Ct值的倒数与对照基因（GAPDH）Ct值倒数的比值代表目的基因 mRNA 的相对表达水平.

　　2结果

　　2.1扩增纯化后的病毒鉴定与病毒滴度测定经扩增、纯化后，PCR及测序证实所携带的目的基因信息无丢失或变异，Ad?H564/402滴度达到（6.29±0.26）×1014 OPU/L，能够满足动物实验的需要.

　　2.2骨骼肌中HIF?1α mRNA的相对表达量以Ad?H564/402组的基因相对表达量最高，各组间的差异有统计学显著性意义（P=0.000，表1）. 以第7日相对表达量最高，差异有统计学显著性意义（P=0.000）. 且不同基因组与转染天数对基因表达量的影响有交互作用. 基因转染后第1, 3, 5, 7 d Ad?H564/402组的基因相对表达量均高于其它各组，经两两比较（LSD法），差异均有统计学意义（P=0.000）.

　　2.3大鼠下肢动脉血管造影 假手术组极少见侧支血管，Ad?LacZ组术侧的侧支血管显影清晰，但未见对侧明显的侧支血管形成. 而Ad?H564/402与Ad?H0两组双侧下肢均可见较为密集的侧支血管，但两组差异不明显（图1）

　　2.4 血管铸型对比术侧下肢相同平面的微小血管密度，Ad?H564/402组较其他各组的管径更小，密度更高，并可见较多聚集成团的绒毛样微血管（图2）.

　　表1骨骼肌中HIF?1α mRNA的相对表达量（略）

　　组间：F=101.809, P=0.000; 转染日数间：F=7.141, P=0.000; 组间×转染日数间：F=22.446, P=0.000.NS: 生理盐水；Ad?LacZ：β?半乳糖苷酶基因；Ad?H0：野生型人低氧诱导因子1α；Ad?H564+402：564与402双位点突变的人低氧诱导因子1α.

　　A:假手术组; B: Ad?LacZ组; C: Ad?H0组; D: Ad?H564/402组.
 
　　图1基因转染后28d选择性下肢血管造影（略）

　　A:假手术组; B: Ad?LacZ组; C: Ad?H0组; D: Ad?H564/402组.

　　图2基因转染后28d血管铸型（略）

　　3讨论

　　新生血管形成被认为是对细胞缺氧的适应性反应［6］. 主要有3种方式: 大血管形成、动脉形成及小血管形成. 组织缺氧、损伤及伤口愈合等病理情况下，从已存在血管上形成毛细血管被称作Angiogenesis, 它需要VEGF, Ang1 和ephrin?B2等多种因子的参与，进而吸引平滑肌细胞参与形成完整的血管结构［7］. 低氧刺激可诱导HIF?1α产生，而HIF?1α可通过促进下游一系列靶基因（如VEGF,VEGFR1, VEGFR2, NOS, IGF?Ⅱ等）的转录，触发机体血管新生的反应, 促进侧支循环的建立.

　　HIF?1α在常氧水平下极易降解，主要是通过羟化酶和泛素系统完成［8］. 低氧状态下脯氨酰羟化酶活性受到抑制，402和564位的脯氨酸（prolyl, pro)羟基化反应受阻，导致HIF?1α降解途径中断，细胞内HIF?1α水平增加［9］. 国内外已有将HIF? 1α基因通过质粒或者疱疹病毒等载体转染促进大鼠和兔等动物肢体血管新生的报道［10-11］，但有关突变体HIF?1α基因的实验资料尚少见报道. 在本实验中，我们将Pro402和Pro564突变为丙氨酸（Ala402和Ala564）后，使得HIF?1α在常氧下降解受阻，作为外源性基因转染缺血动物模型后促进了体内的HIF?1α mRNA高表达；同时由于402和564位定点诱变后，脯氨酰羟化酶活性受抑，解除了经FIH抑制HIF?1α与辅助激活因子结合的作用，从而导致HIF?1α转录活性增强，对缺血动物模型的促侧支血管形成及微血管新生作用强于野生型HIF?1α基因. 我们还观察到，野生型HIF?1α基因转染大鼠缺血模型后，同样使得体内HIF?1α mRNA表达水平增高，可能是由于腺病毒感染效率高，转染外源性野生型HIF?1α基因后导致了HIF?1α核酸及蛋白水平过高表达，超出了细胞降解的能力范围之外所致. 我们的实验结果验证了突变体HIF?1α基因的生物学功能，丰富了HIF?1α基因的研究内容，为进一步的临床应用提供了实验依据.

　　但由于客观条件的制约，实验观察仅维持到术后4 wk，时间尚短，不足以确定长期效果，未能观察到腺病毒载体的远期副作用. 对血管造影及动脉铸型结果的分析，尚缺乏的量化或半量化的标准，有待进一步研究.

【】
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