siRNA沉默HIF?1α在缺氧状态下对食管鳞癌细胞VEGF表达的影响
作者：吴欣爱，孙燕，樊青霞，王留兴，王瑞林，赵培荣，张岚
【摘要】 目的 观察体外乏氧培养条件下食管鳞癌细胞系EC9706中HIF?1α和VEGF的表达，探讨HIF?1α在低氧条件下对食管鳞癌血管生成的调控作用。方法 CoCl2化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境，RT?PCR、免疫组化法和免疫印迹法分别检测缺氧状态下HIF?1α和VEGF在mRNA和蛋白水平的表达。采用化学合成小干扰RNA（siRNA）介导的RNA干扰技术（RNAi）用siRNA转染EC9706细胞。观察转染后HIF?1α沉默效果。结果 低氧条件下，EC9706细胞HIF?1α mRNA水平稳定，蛋白表达显著升高，而VEGF mRNA和蛋白的表达均显著升高。SiRNA转染EC9706后能够显著下调HIF?1α的基因表达，同时VEGF基因的表达也受到明显抑制。结论 缺氧促使EC9706细胞HIF?1α在蛋白水平表达升高，并通过转录激活VEGF的机制调控食管鳞癌血管生成。
【关键词】 食管鳞癌;乏氧诱导因子?1α;血管内皮生长因子;双链RNA;RNA干扰
恶性肿瘤快速生长和肿瘤内部血液供应相对不足导致肿瘤内部形成缺氧微环境。低氧是实体肿瘤微环境的基本特征之一。缺氧条件下，肿瘤细胞内许多基因的转录和表达发生变化，对缺氧作出应激反应。引起肿瘤的侵袭性增加和对放化疗的抗拒性增加，而在这个过程中转录因子乏氧诱导因子?1 （hypoxia?inducible factor 1 alpha,HIF?1α）起中枢纽带作用[1]。乏氧引起的一些酶或因子的变化大多是通过HIF?1α起作用。其在食管癌血管生成中的调控作用，尚未见详细报道。本研究以食管鳞癌细胞系EC9706为研究对象，通过体外模拟肿瘤缺氧微环境，利用RNA干扰技术观察小干扰RNA转染EC9706细胞前后低氧条件下HIF?1α和VEGF的表达，初步探讨HIF?1α在缺氧条件下对食管癌血管生成的调控作用。
1 材料和方法
1.1 材料
食管鳞癌细胞系EC9706由医学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验王明荣教授惠赠。HIF?1α siRNA(h)、Control siRNA?A 、siRNA转染试剂及HIF?1α抗体均购自Santa Cruz公司。RT?PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，VEGF抗体购自武汉博士德公司，SP免疫组化试剂盒购自北京中杉生物技术公司
1.2 方法
1.2.1 细胞体外乏氧培养条件的建立
EC9706细胞用含10%新生牛血清的RPMI1640培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养。化学缺氧剂CoCl2加入培养基的终浓度为75μmol/L，用于模拟肿瘤内部缺氧微环境。
1.2.2 半定量RT?PCR检测mRNA表达
EC9706细胞于低氧条件下培养8h，Trizol法提取细胞总RNA，逆转录反应体系（20μl）组成为：DEPC水7μl，5×Buffer 4μl，dNTPs（10nM）2μl，Oligo（dT）1μl，RNase抑制剂 1μl，总RNA 4μl，逆转录酶1μl，37℃ 5min， 42℃ 1h，70℃10min灭活逆转录酶。PCR引物序列如下：HIF?1α上游5′? CCT GCA CTC AAT CAA GAA GTT GC ?3′，下游5′? TTC CTG CTC TGT TTG GTG AGG CT ?3′（618bp）；VEGF上游5′? CAC ATA GGA GAG ATG AGC ?3′，下游5′? CCG CCT CGG CTT GTC ACA ?3′（230bp）；β?actin上游5’? CAT CCT GCG TCT GAC CT ?3’,下游5’? TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG ?3’(480bp)。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，数码照相并行灰度值分析。
1.2.3 免疫组化SP法检测低氧条件下HIF?1、VEGF蛋白的表达
缺氧处理8h后收获细胞爬片，4%多聚甲醛固定10min，按照试剂盒说明进行。HIF?1α、VEGF多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，SP试剂盒购自中杉生物技术有限公司。
1.2.4 siRNA转染EC9706细胞
转染前24h 以 4×105/ml密度接种细胞于6孔培养板，待细胞生长至60%～70%融合时进行转染。按试剂盒说明进行。分别设siRNA转染组及Control siRNA组。转染32h后，更换含化学缺氧剂CoCl2培养基继续培养8h，收集细胞进行相关指标检测。
1.2.5 HIF?1α基因沉默效果的测定
低氧培养4、8h后，分别提取未转染组、转染阴性对照组和转染组的细胞蛋白考马斯亮蓝蛋白定量。10%十二烷基硫酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后，380V转移30min，凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，加入HIF?1α抗（1∶1000稀释），37℃孵育2h，PBS漂洗，在封闭液中加入辣根酶标记的羊抗兔二抗，37℃孵育1h，PBS漂洗。最后用ECL?PLUS试剂孵育，胶片曝光显示特异电泳条带，照相，行图像分析。HIF?1α抑制率=（未转染组灰度值?RNA干扰组灰度值）/未转染组灰度值×100%。
1.2.6 HIF?1α基因沉默后对VEGF表达的影响
分别采用RT?PCR及免疫组化法检测转染后EC9706细胞VEGF mRNA水平及蛋白水平的变化。
1.3 统计学分析
采用SPSS统计软件，配对组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 缺氧HIF?1α、VEGF mRNA表达的变化
缺氧处理8h后，提取培养细胞的总RNA，RT?PCR检测HIF?1α、VEGF、mRNA的表达情况，结果显示：EC9706细胞中HIF?1α mRNA常氧条件存在表达，缺氧8h后，其表达没有明显改变（P>0.01)，见图1A。而VEGF mRNA的表达在缺氧后显著升高。缺氧8h后，VEGF、mRNA的表达提高了6.12倍（P<0.01），见图1B。
2.2 缺氧对HIF?1α、VEGF蛋白表达的影响
免疫组化法表明：常氧条件下，EC9706细胞HIF?1α蛋白表达阴性，VEGF呈弱阳性，蛋白表达定位于胞浆。缺氧8h后，HIF?1α表达呈强阳性，可见强棕黄染颗粒定位于胞浆和(或)胞核，VEGF蛋白表达也明显增强,见图2。
2.3 siRNA对HIF?1α蛋白表达的影响
采用免疫印迹（Western blot）定量分析乏氧条件下HIF?1α蛋白表达及RNA干扰的效果。结果显示：乏氧4h HIF?1α蛋白即可稳定高表达,见图3。siRNA转染细胞后，HIF?1α蛋白表达明显降低，HIF?1α表达抑制率为90%，而未转染组及转染阴性对照组HIF?1α蛋白没有明显改变，见图4。免疫组化法显示siRNA转染后，细胞染色明显减弱，仅见个别细胞着色，见图5。
2.4 HIF?1α基因沉默后VEGF mRNA表达水平的变化
以目的产物/内参照的灰度值比值进行半定量分析，结果显示：转染siRNA组EC9706低氧条件下培养细胞VEGF mRNA水平明显受到抑制，而阴性对照组与未转染组之间没有显著的差异（P<0.05),见图6。
2.5 免疫组化法检测siRNA转染对VEGF蛋白表达的影响
正常对照组、转染阴性对照组细胞染色强。siRNA转染组细胞染色较弱，且不均一，仅见少数细胞着色,见图2。
3 讨论
缺氧是实体肿瘤生长的微环境特征之一。当肿瘤体积为3～4mm3时，自身的血液供应就不能满足肿瘤细胞快速生长的需要，因此肿瘤内部总处于相对缺血、缺氧的微环境。为了保持能量供应，肿瘤细胞基因表达作出适应选择，促血管生成能力极大提高。在血管生成过程中，VEGF被认为是一个最主要的调节因子。能够促进内皮细胞的增殖和迁移。有研究表明，缺氧微环境中肿瘤细胞VEGF合成可以增加十余倍。Liu等[1]研究最早表明缺氧导致肿瘤高表达VEGF主要是通过一种被称为缺氧诱导因子HIF?1的核转录因子实现的。
HIF?1属于bHLH?PAS转录因子家族，基因定位于人染色体14q21～24，是一个由HIF?1α和HIF?1β组成的异二聚体结构，两个亚单位的相对分子质量分别为120×103和（91～94）×103[2]；每个单位均包括有氨基酸末端的bHCH?1PAS结构，它是两个亚单位聚合所必需的结构[2]。研究表明HIF?1中，亚单位HIF?1α是一个新发现的含826个氨基酸的多肽，在位于401～603区域有一个氧依赖隆解区(oxygen?dependent degradation domain,ODD)[3]。它对氧的依赖性较强，而HIF?1β对氧的依赖性较弱，但在HIF?1中也不可缺少。因此，下调HIF?1α的表达有利于抑制肿瘤血管生成[4,5]。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是近年来起来的新技术，由双链RNA引起的mRNA特异性降解而引起的基因沉默。具有抑制作用强、稳定性高、细胞摄取相对容易等优点[6,7]，RNAi技术目前已成为基因功能组学和基因研究的一种重要方法[8,9]。本实验应用RNAi技术，通过CoCl2化学缺氧法模拟肿瘤缺氧微环境，观察HIF?1α基因沉默前后VEGF蛋白和mRNA水平的改变，从分子水平阐明低氧条件下HIF?1α对VEGF的调控。
目前，乏氧在哪个水平上影响HIF?1α后达到调节其下游基因的目的仍有争议。目前多数研究表明，乏氧时引起HIF?1α蛋白水平上的改变明显，而mRNA水平的变化则不明显[9]。进一步研究发现乏氧引起HIF?1α蛋白表达增加主要是该蛋白稳定性增强的结果。因此，常氧条件下HIF?1α蛋白容易降解，其半衰期<5min，而在乏氧时则降解阻止[10]。本研究结果表明，细胞在乏氧4h后即出现HIF?1α表达增加，再氧合4h后，HIF?1α很快降解。进一步提示HIF?1α在缺氧细胞中很快被诱导，在细胞回到正常氧条件下更快地降解。其他研究表明，HIF?1α是哺乳动物体内降解最快的蛋白质，缺氧条件下HIF?1α的稳定性增加，半衰期也延长[11]。对于HIF?1α激活的分子机制研究报道不一，大多数学者认为低氧在转录后即蛋白水平对HIF?1α进行调控，也有学者认为低氧在转录水平调控HIF?1α[12]。本研究结果表明，在体外低氧条件下，食管鳞癌细胞HIF?1α mRNA水平表达相对稳定，而蛋白水平表达增高，进一步证明低氧主要是通过蛋白水平对HIF?1α进行表达调控。而且在低氧处理后，VEGF在mRNA水平和蛋白水平的表达都极大提高，提示缺氧是促进食管鳞癌中VEGF生成，肿瘤新生血管形成的重要因素。通过RNAi技术，采用siRNA转染食管鳞癌细胞，RT?PCR检测HIF?1α mRNA水平、免疫印迹方法检测HIF?1α蛋白水平，抑制率均在90%左右。RT?PCR及免疫组化法检测HIF?1α基因沉默的EC9706细胞VEGF表达的变化，结果表明，HIF?1α siRNA沉默HIF?1α基因后EC9706细胞缺氧导致VEGF上调机制被阻止，VEGF在mRNA蛋白水平表达均显著下调，进一步证明HIF?1α参与低氧条件下VEGF生成。
本研究结果表明，与大多数实体肿瘤一样，食管鳞癌细胞中也存在缺氧耐受的分子机制，在食管鳞癌细胞中，低氧主要是通过蛋白水平对HIF?1α进行表达调控。
靶向血管治疗肿瘤的研究目前已进入临床试验缺氧启动血管新生只是肿瘤保持能量供应的重要信号通路之一。因此，切断HIF?1α激活通路是切断肿瘤能量供应开关的关键一步[5]。
【】
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