核仁磷酸蛋白突变与血液肿瘤
【摘要】 核仁磷酸蛋白（NPM）是一类穿梭于核仁、核质和胞质的蛋白质。最近在核型正常的急性髓系白血病和少数骨髓增生异常综合征中发现有NPM基因突变及其蛋白的胞浆移位，突变的NPM可能通过下调肿瘤抑制因子Arf启动p53活性和诱导细胞周期停止而促进细胞恶性增殖。临床研究提示，NPM突变与急性髓系白血病患者的预后相关，并且可作为微量残留白血病的监测指标。这些发现提示NPM突变可能在髓系白血病的发生中具有重要作用。本文就NPM突变在血液肿瘤中的研究进展做一综述。
【关键词】 核仁磷酸蛋白 血液肿瘤 Arf；P53
Nucleophosmin Mutations in Hematological Malignancies —— Review
Abstract Nucleophosmin (NPM) is a protein that shuttles between the nucleus, nucleoplasm and cytoplasm. NPM gene mutations and aberrant cytoplasmic NPM localization have been recently described in acute myelogenous leukemia (AML) with normal karyotype and in a few myelodysplastic syndromes. Expression of NPM mutant reduces the ability of Arf to initiate a p53 response and to induce cell cycle arrest. Clinical research has revealed that NPM mutations are relative to prognosis and can be used to monitor and quantify minimal residual disease (MRD) in AML patients with normal karyotype, therefore, these findings indicate that nucleophosmin mutations might contribute to illustration of myeloid leukemogenesis. In this paper, the research progress of nucleophosmin mutations in haematological malignancies was reviewed.
Key words Nucleophosmin；haematological malignancies； Arf；P53
核仁磷酸蛋白（nucleophosmin, NPM、B23、NO38或NPM1）是位于核仁颗粒区的主要蛋白分子之一，能穿梭于核仁、核质和胞质之间，参与核糖体前体运输和合成及中心体的复制，进而调控细胞的周期进程和增殖发育。NPM高表达于增殖活跃的细胞包括肿瘤细胞和干细胞，在肿瘤形成过程中发挥重要作用。实体肿瘤细胞往往高表达NPM基因，产生过量核仁磷酸蛋白，促进细胞恶性增殖和抵抗凋亡［1］。在血液系统恶性疾病中最常见累及NPM 1的基因重排，它与其它基因（RARa、MLF1、ALK）形成致癌性的融合蛋白，促进急性早幼粒细胞白血病（M3）、骨髓增生异常综合征（MDS）和淋巴瘤的发生［2］。尽管如此，NPM基因高表达或基因重排在血液肿瘤并不常见。最近研究发现，NPM基因突变是白血病发生的主要分子事件之一，累及急性髓系白血病（AML）的多种亚型，尤其是具有正常核型的髓系白血病细胞中，少数MDS病例也发现有NPM突变［3］。白血病细胞NPM突变只是导致胞浆中出现大量的核仁磷酸蛋白，但并不伴有除FLT3以外的其他已知的AML致癌基因的改变，提示NPM突变可能在核型正常的血液肿瘤的发生中具有启动作用。因此，本文对核仁磷酸蛋白突变在血液肿瘤中的研究进展做一综述。
NPM的结构和功能
人类NPM基因位于染色体5q35，基因全长约23 kb，编码由294个氨基酸组成的蛋白质。从分子结构上核仁磷酸蛋白可分为3个区域： 同源寡聚体结合区、核仁定位信号区和酸性氨基酸区。在正常情况下核仁磷酸蛋白主要位于核仁颗粒区，但是可以穿梭于核仁、核质和胞质而发挥重要作用。
实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3)核仁磷酸蛋白突变与血液肿瘤核仁磷酸蛋白是一种多功能的蛋白质。一方面，NPM具有核糖核酸内切酶活性，通过参与28S rRNA的形成，进而促使核糖体的合成［4］；同时NPM可作为细胞周期依赖性蛋白激酶2（CDK2）/细胞周期蛋白E（cyclin E）复合物的直接底物，被CDK2/cyclin E磷酸化后从中心体中解离出来，中心体才能得以复制，这提示NPM在调控周期进程和促进细胞增殖中发挥重要作用［5］。另一方面，NPM作为分子伴侣，能够阻止核仁内多种蛋白质的聚集，并稳定另起读框（alternative reading frame, ARF）蛋白滞留于核仁内［6］。此外，NPM还可离开核仁，穿梭于核质和胞质之间，调节p53等多种肿瘤抑制因子的活性，从而在细胞凋亡调节中发挥重要作用。
NPM突变在血液肿瘤中的表达
最近研究发现，NPM对于胚胎发育和保持遗传稳定性是必需的。一方面，NPM1基因失活可导致无限制的中心体复制和基因组失稳；另一方面，在胚胎发育第11.5—16.5天，NPM1?/? 和NPM1hy/hy突变可使小鼠因造血功能缺陷导致的贫血而形成器官发育异常甚至死亡，而NPM1+/?小鼠则可发育出具有人类MDS特征的血液综合症。这揭示了NPM基因在发育过程中的基本作用，其功能的缺失是肿瘤和MDS发生的重要原因［7］。
NPM突变在急性髓系白血病中的表达
最近Falini等［3］在对591例成人急性髓系白血病（AML）NPM基因表达的研究中发现，其中208例AML患者(占35.2%)白血病细胞胞浆中检出NPM蛋白，NPM基因突变导致大量的NPM分子从核仁移位至胞浆，因此把基因突变致NPM胞浆移位的白血病细胞称之为NPMc+ 细胞。这种NPMc+细胞分布在除M3、M4eo、M7以外的其它急性髓系白血病FAB各亚型中。进一步研究发现，在成人AML病例中，女性患者NPM突变发生率比男性患者要高1.5倍，提示在成人病例中NPM突变发生率存在着性别差异［8］。此外，在对85例40岁以下的AML病例研究中发现，NPM突变的仅有3例（占3.5%），年龄较小患者NPM突变的发生率明显低于年龄较大患者，说明成人AML患者NPM突变率随着年龄的增大而增高，呈正相关［9］。对于儿童AML中NPM突变的情况，Cazzaniga等［10］做了详细的研究，在107例儿童（其中10岁以下的有62例，10岁以上的有45例）AML病例中，NPM突变的病例仅占6.7%，而Falini［3］发现35.2%的成人AML患者存在NPM突变，表明在儿童AML中NPM发生突变的可能性比成年病例要低得多。进一步详细分析NPM突变的儿童AML患者的临床特点，发现在性别和白细胞计数方面，NPM突变型（NPM?mut）和NPM野生型（NPM?wt）病例没有显著的差异，但是在年龄上存在明显的趋势，年龄大于10岁的儿童AML患者中有35.7%发生NPM突变，说明对于年龄较大的儿童，发生NPM突变的可能性相对地说较高。这与在成人患者中NPM突变的发生率与年龄呈正相关的特点相似。
相对于急性髓系白血病而言，在慢性髓系白血病中NPM突变并不普遍。Jonathan等［11］研究发现，如果在慢性髓系白血病患者中一旦出现了NPM突变，这就提示慢性髓系白血病极有可能在短期内迅速地成为AML，使得患者的预后较差。目前在淋巴细胞白血病中NPM突变尚未见报道，这可能与这类血液肿瘤往往有明确的基因易位，并伴有异常核型有关。
NPM突变在骨髓增生异常综合征中的表达
除了在AML中发现有NPM突变以外，最近Zhang等［12］在38例原发性骨髓增生异常综合征(MDS)病例中，发现2例有NPM突变 (占5.2%)，分别是难治性贫血（RA）和难治性贫血伴原始细胞增多症I型（RAEB?I）。虽然这两例病人表现出异常的核型，但均未涉及NPM1所在的5号染色体的改变。而以往人们普遍认为，在MDS患者5号染色体上NPM1所在区域缺失，常常发生染色体易位而产生NPM?MLF1融合基因。因此，作者认为该研究首次证实了在MDS中也存在NPM突变，并提出除了NPM1有关的染色体易位外，NPM突变也可能参与了MDS的发病机制，但其具体机制还有待进一步研究。
NPM突变的细胞生物学特征
进一步研究NPMc+细胞的生物学特征发现，NPMc+细胞除了拥有正常核型外，其他已知的AML致癌基因如MLL、DEK?CAN基因等均未见异常［13，14］。尽管NPMc+细胞中FLT?3基因内部串联重复（FLT3?ITD）频繁发生突变，其突变发生率显著高于胞浆中不含突变NPM（NPMc-）的AML病例，但是NPM的胞浆移位与FLT3?ITD的突变发生率具有独立的相关性。分析NPMc+累及的细胞亚群，发现NPM突变细胞不表达CD34干细胞表型，但常常表现为CD133-、HLA?DR- 、FLT?3+并且累及多谱系，提示并不是所有白血病细胞都存在NPM突变，NPMc+可能累及早期祖细胞水平［3］。采用基因芯片技术进一步对NPMc+细胞基因表达谱进行对比分析，发现NPMc+细胞高表达维持造血干细胞表型和增殖的基因，如HOX基因、Notch1?ligand JAG1基因。这些研究结果提示，在异质性的白血病细胞群中NPMc+可能累及造血祖细胞甚至更早期的造血干细胞［15］。
NPM突变导致胞浆移位的分子机制
NPM突变是如何形成的呢？突变型NPM又是通过怎样的机制离开核仁进入胞浆的呢？现在对此已研究得比较清楚。
NPM突变的类型
NPM突变基因是杂合型的，在基因座上保留了1个野生型的等位基因。目前发现有40种NPM基因突变的变异体，都是由在外显子12的不同位置插入不同的核苷酸而产生，主要以6种变异体（mutation A?F）为主，其中最常见的是mutation A，它是在野生型NPM核苷酸序列上第956?959位上插入1个TCTG 4个核苷酸而形成串联重复序列；mutation B、C、D是在野生型NPM核苷酸序列上第960位之前插入了4个不同碱基而产生；而mutation E、F是由于缺失了野生型NPM核苷酸序列第965?969位上的GGAGG碱基序列，但随后插入了2种不同的9个碱基的序列而产生［16］，如附表所示。
突变NPM胞浆移位的分子机制
Mutation A?F均导致了NPM基因外显子12的移码突变，使NPM蛋白C末端的7种氨基酸被11种氨基酸残基所取代，从而导致NPM蛋白C端的288和290位点上至少有1个色氨酸发生突变而产生一个核输出信号，最终使NPM移位到胞浆［17］。但是最近Nakagawa等［18］提出，在野生型NPM分子结构中C端的色氨酸只是对NPM的核仁定位起主要作用，而对NPM的胞浆移位不起主要作用；他同时还提出在突变NPM的C端中存在一种核输出信号序列（NES），由疏水性氨基酸残基序列所组成，其共有序列为Lx(1?3)Lx(2?3)LxL(L为亮氨酸，x代表任何氨基酸)。NES中的分子被核输出信号受体CRM1所识别，从而产生核输出信号，导致NPM移位到胞浆。在此基础上，Falini等［19］将突变NPM（mutation A?D）基因转染入正常成纤维NIH3T3细胞，发现突变NPM蛋白聚集在胞浆中。如果利用CRM1的抑制剂LMB处理NPM胞浆移位的NIH3T3细胞，发现突变NPM能够重新定位于核质，进一步证实突变NPM移位胞浆是通过CRM1依赖途径。另外，在野生型NPM的N端92?104位点有1个生理性的NES序列，若将此NES序列敲除或者将C端突变产生的NES序列敲除，然后将NES序列敲除的NPM基因转染入NIH3T3细胞，发现无论敲除N端还是C端的任意一种NES序列，NPM都只能出现在核质中而不能聚集在胞浆中，这说明突变NPM只有在同时具有两种NES序列的情况下才能实现其胞浆的聚集。以上均说明了突变NPM在胞浆中的异常表达不仅仅只是依赖某一种氨基酸或某一种NES序列，而是多种因素共同作用的结果。
NPM突变参与白血病发病的分子机制
在正常核型的白血病细胞中，NPM基因突变只是导致核仁磷酸蛋白的胞浆移位，并不同时伴发其它已知AML致病基因的改变，那么，NPM基因突变及其胞浆移位在白血病的发病机制中具有什么样的作用呢？能否成为正常核型AML发病的始动因素？在生理条件下，野生型NPM通过直接与P53的相互作用引起P53在细胞内重新分布（机制尚不清楚），进而稳定和增强P53活性，同时P53靶基因P21的mRNA水平也相应增高，使细胞的增殖受到抑制，因此NPM高表达能够通过增加P53的稳定性而抑制细胞的增殖并引发细胞凋亡［20］。NPM突变后对P53活性的直接作用虽然尚未见报道，但是突变NPM能够通过Arf－P53途径间接调节P53的活性。在正常情况下，野生型NPM在稳定Arf上也起着一定的作用。NPM与Arf结合后，一方面将Arf固定于核仁，使Arf免受蛋白酶体的降解作用；另一方面NPM与新合成的ARF结合，充当ARF的分子伴侣稳定其结构，保护Arf免受降解或聚集，从而使Arf在细胞中处于一个稳定的水平，抑制细胞过渡增殖［21，22］。另外，当NPM水平过度增高后，Arf也能降解NPM，从而形成NPM?Arf的负反馈调节环［23］。当NPM发生突变后，突变的NPM与野生型NPM竞争结合Arf。同时由于NPM突变在C端产生了一个依赖CRM1的核输出信号序列，突变NPM将携带ARF从核仁进入胞浆，从而Arf的活性和稳定性降低，半寿期明显缩短［24］。Arf是一种抑癌蛋白，它的失活或水平降低一方面将无法结合人双微体蛋白（HDM2，鼠双微体蛋白称之为MDM2），HDM2得以发挥对P53转录活性的负调控作用，从而导致P53依赖途径的失活；另一方面，Arf自身就有抑制核糖体合成、阻止细胞周期的功能，因此它的失活也将导致P53非依赖途径失活，刺激核糖体合成和促进细胞周期进程，使细胞过度增殖［25，26］。尽管NPM突变可导致抑癌基因Arf和P53的失活，加上FLT3致癌基因的刺激，可能促使NPM突变细胞发生恶性转化，是导致白血病发生的重要分子机制。然而，根据以往的研究所知，P53活性是维持基因组稳定性的重要因素，若P53失活将导致细胞基因组的不稳定。但是目前的研究发现，NPM突变引起P53失活这一事件却往往出现在核型正常的AML中，因此NPM突变及其P53失活在核型正常白血病患者发病中的详细机制还有待深入探讨［27］。
NPM突变的临床意义
NPM突变不仅主要出现在核型正常的AML患者细胞中，而且成人NPMc+的AML病例对化疗药物诱导的缓解敏感，因此Schnittger等［28］提出可以把NPMc+作为预测AML预后良好的因素之一。然而，NPM突变患者往往同时存在FLT3?ITD突变，而在药物诱导AML缓解的试验中，发现FLT3?ITD突变能够降低患者的完全缓解率(CR)，因此单纯NPMc+的AML患者预后较好，若同时伴随FLT3?ITD突变，将会影响AML患者对化疗药物诱导的缓解效果［5］。因此，在实际应用中，不仅要检测突变NPM，还要同时检测FLT3?ITD突变，并结合年龄等其它因素，综合判断原发性AML的预后［29］。
如何监测微量残留白血病（MRD），从而达到有效并最终根治白血病的目的，一直是血液肿瘤学研究的热点。但到目前为止大部分核型正常的AML还没有可供选择的特异性指标。最近研究发现，NPM突变可作为监测MRD的新指标。利用RQ?PCR检测突变NPM基因cDNA的拷贝数，从而对MRD做出监测。在13例NPM突变的AML患者中，突变NPM基因的cDNA拷贝数均大于30 000。经过药物治疗后，其中有10例获得血液学缓解，其突变NPM基因cDNA的拷贝数明显下降，而药物治疗无效的3例患者其突变NPM基因cDNA的拷贝数下降程度很小或不下降。这表明突变NPM基因cDNA的拷贝数与患者的临床状况有显著的相关性，因此NPM基因突变可作为监测MRD的新指标［16］。
结 语
NPM是一种多功能的核仁磷酸蛋白，参与核糖体前体和其它蛋白的胞浆?胞核穿梭运输，调节细胞周期和凋亡过程，在肿瘤的生长发育中起着重要作用。在核型正常的血液肿瘤中，NPM常常发生突变从而导致其移位至胞浆，突变NPM导致Arf失活，通过依赖或非依赖p53途径促进白血病细胞恶性增殖。但是NPM突变后如何参与控制中心体的复制使细胞仍然具有整倍体的属性，从而维持白血病细胞的正常核型？NPM突变p53失活后白血病细胞是如何维持基因组的稳定性？细胞恶性增殖需要大量核糖体的合成、组装和运输这又是通过怎样的机制而进行的？这些问题都有待研究查明。由于在正常核型的AML患者中，往往只有NPM突变这一分子特征，不伴有除FLT3以外的其他已知AML致癌基因的改变。因此，针对突变NPM的靶向分子治疗有可能成为治愈核型正常血液肿瘤的有力手段。
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