酪氨酸激酶异常活化在恶性血液病发病中的作用
【摘要】 蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase, PTK)在调节细胞生长、活化和分化的信号转导中起着重要的作用。基因突变(多半由染色体移位)或者激酶的过度表达可使PTK活力异常增高,并介导异常的信号转导途径,在多种恶性血液病的发生中起着主要的作用。在慢性骨髓增殖性疾病(CMPD)、急性髓性白血病(AML)和间变性大细胞淋巴瘤的发病中,均存在着PTK的异常活化。进一步研究PTK相关的恶性血液病的发病机理,可以加快特异性的分子靶向的研究进展。
【关键词】 酪氨酸激酶 恶性血液病; 基因突变
Abnormal Activation of Tyrosine Kinases and Its Role in the Pathogenesis of Hematological Malignancies ——Review
Abstract Protein tyrosine kinases are key participants in signal transduction pathways that regulate cellular growth, activation and differentiation. Aberrant PTK activity resulting from gene mutation (often accompanying chromosome translocation) or overexpression of these enzymes plays an etiologic role in several clonal hematopoietic malignancies. Other than the causative effect of PTK product of the bcr/abl fusion gene on chronic myelogenous leukemia (CML), more evidence suggests that mutated tyrosine kinases are pivotal in the pathogenesis of most of other chronic myeloproliferative disorders, such as chronic myelomonocytic leukemia (CMML) and hypereosinophilic syndrome (HES). And the exciting results in several dependent groups in 2005 showed that a single nucleotide JAK2 somatic mutation (JAK2V617F mutation) was found to be involved in the pathogenesis of polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and chronic idiopathic myelofibrosis (CIMF). In the leukogenesis of acute myeloid leukemias (AML), the losing of the control of the proliferation of hematopoietic progenitor cells was principally the results of the aberrant PTK activity, such as FLT3 and C?kit overexpression. It works together with the loss of function mutation genes in promoting progenitor cell differentiation to confer AML's phenotypes. These upregulated PTK molecules represent attractive disease?specific targets, to which a new class of therapeutic agents are being developed. This review focuses on abnormal tyrosine kinases that have been involved in the pathogenesis of hematopoietic malignancies.
Key words protein tyrosine kinase; hematopoietic malignancy; gene mutation
蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase, PTK)活力增高,介导的异常的信号转导途径在多种恶性血液病的发生发展中起着主要的作用[1]。造血干细胞水平PTK相关基因的活化性突变,引起配体非依赖性信号途径活化,从而使细胞呈现生长因子非依赖性生长,即恶性转化。基因突变通常由染色体移位引发PTK的异常活化,如bcr/abl融合基因与慢性髓性白血病(CML)发病的因果关系;另外,基因突变也可以由PTK本身不同结构域基因突变导致抑制其活化的基因缺失而引发,如FLT3内部串联重复与急性髓性白血病(AML)的关系。现按病种分述如下。
PTK突变与慢性骨髓增殖性疾病(CMPD)
STI571研究的成功,使得PTK在其他恶性血液病发病中所起的作用引起空前的关注。PTK异常活化介导肿瘤性信号转导途径,已经在部分的慢性骨髓增殖性疾病(CMPD)中得以阐明。除了bcr/abl融合基因与慢性髓性白血病这一已为人们熟知的例子外,CMPD中越来越多的PTK相关的异常信号转导被发现,近期JAK2基因突变在真性红细胞增多症等CMPD发病中的作用更是引起广泛关注。
Ph染色体是CML的特殊标记,bcr/abl融合基因由9和22号染色体相互易位形成,其中abl基因编码一个非受体型PTK。由于位于22号染色体上的bcr基因断裂位置的不同,形成3种不同长度的bcr/abl融合基因,并相应地形成3种不同分子量的蛋白产物。最常见的是P210BCR?ABL,它见于95%的CML患者和1/3的Ph阳性的急性淋巴细胞白血病(ALL)患者;P190BCR?ABL 见于其余2/3的Ph阳性ALL患者;P230BCR?ABL见于Ph阳性的慢性中性粒细胞白血病(CNL)患者。
P210BCR?ABL 和P190BCR?ABL的PTK活力明显高于正常的ABL蛋白产物。单是bcr?abl融合基因产物就足以使实验动物发生CML样的骨髓增殖性疾病。例如,小鼠接受P210BCR?ABL 转染的骨髓细胞后,在造血重建过程中发生骨髓增殖性疾病。P190BCR?ABL转染胚胎干细胞也可引起小鼠发生类似的病变。
TEL?PDGFRβ融合基因与慢性粒单细胞白血病(CMML)
血小板衍生生长因子受体β(PDGFRβ)属于Ⅲ型受体型PTK。当与其配体血小板衍生生长因子(PDGF)结合时,受体形成二聚体并相应自磷酸化,将信号逐级传递下去,促进细胞增殖。
Golub等1994年首先发现在少数CMML患者有染色体t(5;12)改变,形成TEL?PDGFRβ融合基因。这一融合将TEL基因序列与PDGFRβ基因上PTK序列的跨膜部分连接起来,临床上无一例外地见于慢性粒单核细胞白血病(CMML)。自此以后,陆续发现了多种累及PDGFRβ基因的其他染色体移位形式,如: HIP1?PDGFRβ、H4?PDGFRβ和MIN?PDGFRβ等。
已经证实,TEL?PDGFRβ可使小鼠Ba/F3细胞由细胞因子依赖性转化为非依赖性,体内实验证明TEL?PDGFRβ可使正常细胞发生恶性变。
FIP1L1?PDGFRα融合基因与高嗜酸细胞综合征(HES)
PDGFRα位于人第4号染色体的长臂(4q12),由1089个氨基酸组成,593?954位属于酪氨酸激酶区,也是Ⅲ型受体型PTK。与PDGFRβ共用配体。
HES发病中存在PTK的突变,其发现过程颇具戏剧性。2001年STI571用于CML的治疗取得重大的进展,有1名8年病程的HES患者试用了STI571,每天仅仅用100 mg,结果4周后嗜酸细胞完全消失。1年后Gleich 等报道,5例HES中4例患者对小剂量STI571有反应,维持治疗阶段每周仅需200 mg。Cools等[2]对这些现象开始了深入的研究,在1组16例患者的研究系列中,他们发现有1例患者存在染色体t(1;4)改变,并发现PDGFRα与一个此前未定性的基因发生了融合,后命名为FIP1L1基因,但这只是一个特例。在这组患者中常规染色体检查正常的患者中还有8例存在FIP1L1?PDGFRα融合基因。其实FIP1L1?PDGFRα融合基因的形成与大多数PTK突变的产生方式不同,它并非染色体移位所致,而是4号染色体长臂1区2带处发生了一段800 kb长的基因缺失,常规染色体显带技术无法分辨,首例识别出的患者因为恰巧有其他染色体移位而引起重视。
FIP1L1?PDGFRα融合基因导致HES的确切机理尚未阐明,推测其与其他基因融合致PTK活化的情况类似。FIP1L1?PDGFRα的融合,使得PDGFRα激酶发生结构性活化,使得信号转导途径下游的分子活化。体外实验中,用该融合基因转染Ba/F3细胞株,细胞发生细胞因子非依赖性生长。
JAKA2基因突变与真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)和特发性骨髓纤维化(IMF)
JAK家族在细胞因子信号转导的初始步骤中起着至关紧要的作用。JAK家族包括4个成员: TYK2、JAK1、JAK2、JAK3,其中JAK2为非受体型PTK,位于9号染色体(9p24),在造血调节中起着重要的作用。其下游STAT 家族是一种能与DNA结合的蛋白家族,与JAK磷酸化信号通路偶联,发挥转录调控作用。它能把细胞外信号与基因表达调控直接联系起来,启动相应基因的转录和表达,完成细胞因子受体(如EPO受体和TOP受体)介导的信号转导过程,发生细胞增殖的效应。
2005年几个不同的研究小组几乎同时报道了有关JAK2基因突变在CMPD发病中的作用[3-5]。研究发现,突变发生在JAK2假性激酶域(pseudokinase JAK2 domain),第617位的缬氨酸被苯丙氨酸所替代(V617F)。因各家采用的PV诊断标准不一,PV患者中JAK2V617F发生率报告不一,自65%至97%,共506例PV患者该突变的总的发生率高达78%。V617F突变也存在于其他bcr?abl阴性的CMPD患者中,如大约50%IMF患者可检测到该种突变;ET患者JAK2V617F检出率变化范围较大,自25%到57%不等。此外,在不典型CML和无法分类的MDS患者,JAK2V617F的检出率可达20%;在HES和CMML患者检出率低至2%?3%;AML患者无该种突变[6]。有学者提出根据JAK2基因突变的情况有可能建立一种新的CMPD的分类方法。
JAK2V617F导致PV的发病,可能与JAK2发生了功能获得性突变有关。将JAK2V617F突变转染细胞因子依赖的细胞株,少部分细胞中突变的JAK2发生自磷酸化,在缺乏细胞因子的条件下,活化其下游的信号转导途径,包括STAT5,ERK/MAP和PI3K/AKT;大部分细胞中突变的JAK2,对Epo/EpoR信号转导途径的活化起促进作用,使得造血前体细胞对细胞因子的敏感性大大提高。模式动物研究中发现,JAK2V617F 导入小鼠造血干细胞并移植给子代小鼠,子代小鼠的表型为红系大量增生和脾肿大等骨髓增殖性疾病的表型[3]。
tel?abl融合基因与白血病
TEL是一个ETS家族的转录因子。tel?abl融合基因由9q34和12p13的易位引起。tel与abl基因的融合形成 tel?abl,在人类白血病中并不多见,迄今只见于个别ALL、AML和非典型CML患者。
TEL?ABL融合蛋白显示增高的ABL激酶活力。tel?abl可将小鼠生长因子依赖型细胞株转化为生长因子非依赖型。TEL?ABL与 BCR? ABL肿瘤蛋白致白血病的机理应该是一致的;且BCR 与TEL在融合蛋白中的主要作用是提高ABL蛋白的PTK活力,从而使细胞的恶性转化。
tel?jak2融合基因与白血病
tel?jak2融合基因(另一个TEL与PTK的融合)所编码的融合蛋白,其JAK2的PTK活力明显增高,且在白血病的发病中起着重要的作用。已有人类白血病含tel?jak2融合基因的报道,表型分别为T细胞性ALL,前B细胞ALL和复杂染色体易位的不典型CML患者。不同病例tel?jak2融合基因的长度,因在基因上断裂点不同而不同。体外实验证明TEL?JAK2蛋白可使正常细胞发生恶性变。TEL?JAK2都显示结构性磷酸化,JAK2/PTK持续性激活,并进一步激活底物STAT5,从而将IL?3依赖的小鼠Ba/F3细胞转化为非依赖性。体内实验证明,移植活化的TEL?JAK2转染的骨髓细胞给受体小鼠,受体均发生了致命性的髓系或淋巴系增殖性疾病。
PTK基因突变与急性髓性白血病(AML)
大量依据表明,急性髓性白血病的发生是一个多步骤的发病过程。二次打击模型推测在已知的两类突变中至少有一种突变,并且只有两者联合作用才可导致AML的发生。第一类突变致细胞增殖的信号失去控制,通常为功能获得性突变,导致信号转导途径的激活或者下游效应蛋白的活化,最终活化STAT,RAS/MAPK和PI3K/AKT使得细胞具有增殖和/或存活优势。在AML发生中赋予造血细胞增殖信号的第一类基因突变,与PTK有关的主要为FLT3基因突变。少见的有累及其他酪氨酸激酶的活化性突变,如tel?jak2融合基因及c?Kit突变引起AML。
FLT3基因突变与AML
FLT3(Fms?like tyrosine kinase 3)是一种受体型酪氨酸激酶,位于13号染色体长臂(13q12),与c?Kit和PDGFR同属Ⅲ型受体型PTK家族,在造血干细胞、树突状细胞、B前体细胞和杀伤细胞的增殖和分化中起着重要的调节作用。
AML患者FLT3基因突变主要表现为两种形式:内部串联重复(internal tandem duplication, ITD)和点突变(point mutation, PM)。两种突变均可造成FLT3酪氨酸激酶的结构性活化,其中FLT3-ITD见于15%-35%成人AML、FLT3点突变见于5%-10%的成人AML;在骨髓增生异常综合症(MDS)患者FLT3基因两种突变形式的发生率分别为5%-10%和2%-5%;在儿童急性白血病中两者的发生率分别为11.5%-15.4%和3.3%-5.8%。Taketani 等[7]报道,MLL基因重组和高倍体染色体的ALL婴儿常常存在FLT3基因点突变。
FLT3基因突变致AML机理仍未阐明,国内已有综述作过探讨[8]。FLT3基因突变已经被公认是AML中发生率最高的一种基因改变。FAB分型中所有的类型均可发生FLT3-ITD,其中M3中FLT3-ITD的发生率最高,可达40%。大量的临床资料提示FLT3异常活化与临床上高白细胞、高复发率有关,提示患者预后不良。多因素分析显示,ITD为判断总的生存率的一个独立预后因素,ITD阳性和阴性患者的总的生存率和5年生存率有显著差异。此外,MDS患者在向AML转化过程中常常发生FLT3-ITD和N-ras基因突变,而前者为MDS预后不良的指标[9]。
c?Kit基因突变与AML
c?Kit原癌基因(又称干细胞生长因子受体,SCFR)位于人第4号染色体的长臂(4q12),是Ⅲ受体型PTK,其配体为干细胞生长因子。c?Kit与机体的造血功能,肥大细胞的发育,黑素生成,配子形成以及Cajal间质细胞的发育密切相关。
c?Kit存在着30多种功能获得性突变形式,发生在不同的外显子,由此引发细胞的异常增殖和生存,它们是许多肿瘤发生、的直接诱因。与之关系最密切的有胃肠道基质瘤(GIST)、肥大细胞白血病和AML。
c?Kit基因突变引起的AML临床并不常见,有报道认为,其仅见于不到8%的AML患者,但是60%-80% AML患者的白血病细胞表达野生型c?Kit,其中部分患者存在过度表达现象。有趣的是,在累及核心结合因子(CBF)的AML细胞(如t 8;21),常常存在c?Kit基因突变[10]。c?Kit基因突变导致AML的发病机制尚未阐明,研究发现c?Kit的816位碱基突变,使c?Kit酪氨酸激酶活性增高10倍,与ATP的亲和力增高9倍,可能异常增高的酪氨酸激酶活性激活了信号转导途径,使造血细胞增殖失去控制。
研究发现,野生型c?Kit活性可被STI571抑制[11] ,而816位突变型的c?Kit对STI571天然耐药,419位c?Kit基因突变的AML细胞是否可被STI571所抑制,暂无定论。因此,进一步明确AML中突变型和非突变性c?Kit过度表达现象产生的机理,已成为国内外研究机构AML靶向研究的重要内容[12,13]。
npm?alk融合基因与间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)
npm(nucleophosmin)?alk(anaplastic lymphoma kinase)融合基因由t(2p23;5q35) 形成,见于30%-40%的ALCL患者。alk编码一个新发现的穿膜受体型PTK,其配体目前尚未明确。在这一融合基因中,npm基因起着启动子的作用,使正常情况下不表达alk基因的细胞发生alk基因的过度表达。
npm?alk融合基因的产物是分子量为80 kD的融合肿瘤蛋白,其转化细胞的能力已得到公认。P80NPM?ALK通过使大鼠纤维母细胞发生锚非依赖性(anchorage independent)生长,增殖率明显增高;此外,它还可使Ba/F3细胞转变为IL?3非依赖性。通过逆转录病毒将npm?alk转染小鼠骨髓细胞,这些小鼠随之发生了T细胞和B细胞性大细胞淋巴瘤。
尽管因npm的独特功能P80NPM?ALK在细胞核内有集聚现象,但NPM对于ALK的转化作用并不是必需的,因为有研究发现:其他基因与alk基因发生融合,也可激活ALK,虽然这些肿瘤蛋白未在核内集聚,仍可使细胞发生恶性转化。这一发现与临床上一些现象完全吻合:多种涉及ALK基因的染色体易位,均可引起ALK的结构性活化而引起ALCL。故这一组疾病又被称为ALK阳性淋巴瘤或ALKoma。
VEGFR高表达与恶性血液病血管新生
实体瘤的进展伴有血管新生已获公认, 研究表明恶性血液病也伴有血管新生。1997年,Perez?atayde等首先在儿童急性淋巴细胞白血病患者的骨髓切片中发现血管新生增加。在一系列促进血管新生的蛋白中,血管内皮生长因子(VEGF)是迄今为止研究最为透彻的,其受体(VEGFR)共有4 种,它们均属于受体型酪氨酸激酶,在VEGF的信号转导途径中起着决定性的作用。
VEGF受体与配体结合后,即发生二聚体化和自身磷酸化,引发VEGF信号转导途径活化,其中VEGFR?2 活化及其信号转导途径效应主要是引起内皮细胞增生、移动,最终导致血管新生。目前无论是实体瘤还是恶性血液病,尚未发现VEGF受体基因突变,但是已经发现野生型的VEGF受体在恶性血液病中处于高度活化状态[14],这与野生型c?Kit在AML中高表达的情况类似。
Bellamy用免疫组织化学的方法检测AML及MDS患者骨髓切片细胞膜上的VEGFR?1及VEGFR?2, 发现多数MDS和AML高表达VEGFR?1,少数MDS及AML高表达VEGFR?2, 有少数病例两种受体同时表达增高。MDS患者骨髓细胞同时高表达VEGF及VEGFR?1受体, 提示VEGF有自分泌的作用。研究还表明两种VEGF受体表达量的高低与患者的存活期无相关性,但VEGF表达量的高低与其存活期呈负相关。该作者认为,VEGF的表达而非其受体的表达决定AML和MDS的生物行为。尽管如此,由于VEGF需要通过VEGF受体介导的信号转导途径完成增殖信号,故VEGF受体仍然是分子靶向治疗的重要靶点。
结 语
综上所述,PTK活力异常在多种造血系统肿瘤的发病中起着重要的作用,随着突变型和野生型PTK信号转导途径的逐步明确,以异常活化的PTK为作用靶点的新药研发取得了很大的进展。除了已被充分肯定的STI571外,Flt3和VEGFR的小分子酪氨酸激酶抑制剂在临床验证已显示了一定的疗效,但距离人们期待的则相差甚远[15]。可以预见的是,随着PTK相关的恶性血液病发病机理的不断阐明,特异性的分子靶向治疗也将进入一个更加广泛和愈加成熟的时代。
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