鼠HMGB1蛋白的原核表达及分离纯化

             作者：赵中夫 杨慧 刘明社 张芸 杨柳絮 封江南

【关键词】  高迁移率族蛋白1；原核表达载体；纯化

　　摘要   目的：克隆小鼠HMGB1基因，构建原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达并分离纯化获得His- HMGB1的融合蛋白。方法：脂多糖刺激后的RAW264.7细胞，提取总RNA，经RT-PCR扩增出含HMGB1的目的片段，克隆于pMD-19T载体，再亚克隆至含有pelB引导肽及His-标签肽的高效表达载体pET-26b(+)，转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导后行SDS-PAGE鉴定目标蛋白表达，用镍鳌合琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化含His-标签肽的目的蛋白。结果：经PCR扩增出大小为648 bp的HMGB1基因片段，成功构建目标蛋白的融合表达载体，经诱导表达及分离纯化，获得了约30 kD的融合蛋白。结论：构建HMGB1的融合表达载体，获得分离纯化融合蛋白His- HMGB1，为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

　　关键词   高迁移率族蛋白1；原核表达载体；纯化

　　Mouse HMGB1 Prokaryotic Expression and Purification

　　Abstract   Objective:To clone mouse High mobility group box 1 (HMGB1) gene and construct the prokaryotic expression vector,to induce and purify the expressed fusion protein HMGB1.Methods:The total RNA was extracted from mouse RAW264.7 cells stimulated by LPS.The sequence including the whole length of HMGB1 was amplified by RT-PCR and inserted into pMD-19T.The combinant vector was used as a template for PCR which was cloned into vector pMD-19T,then subcloned into expression vector pET-26b(+) with  pelB signal sequence and His-Taq sequence.After transforming E.coli BL21(DE3) and four hours induction by IPTG,HMGB1 expression confirmed by SDS-PAGE and the purification was performed by Ni2+-chelate affinity chromatograph.Results:The target DNA sequence of HMGB1 was obtained by PCR.The recombinant expression plasmid pET-26b(+)-HMGB1 was constructed.The Mr.30 000 fusion protein was obtained by IPTG induction and purification.Conclusion:Mouse HMGB1 prokaryotic expression vector was constructed successfully and the purified proteins were obtained.

　　Key words   High mobility group box 1;Prokaryotic expression vector;Purification

　　高迁移率族蛋白B1(High mobility group box1，HMGB1)是广泛存在于真核细胞内的高度保守的非组蛋白染色体蛋白，基本组全长648 bp编码215个氨基酸残基［１］。已有研究表明，HMGB1可由巨噬细胞或单核细胞等主动分泌，或由坏死细胞被动释放，从而作为一种炎症晚期因子参与脓毒症等病理过程［２，３］。研究还发现经脂多糖（LPS）刺激巨噬细胞后HMGB1的分泌量较未刺激明显增多，并且在8 h～12 h达峰值。而HMGB1发挥作用的机制还不是很清楚。因此，分离纯化HMGB1蛋白将对进一步研究HMGB1的生物学功能、与其他细胞因子的相互作用关系等有重要意义。本实验以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象，经LPS刺激后12 h提取细胞总RNA，采用RT-PCR扩增出含HMGB1的目标序列，构建pMD-19T-HMGB1重组载体,亚克隆至高效表达载体pET-26b(+)，诱导表达并分离纯化含His-标签肽的HMGB1融合蛋白。

　　1   材料和方法

　　1.1   材料      小鼠RAW264.7细胞购自中科院上海细胞生物所细胞库，由本室传代培养；LPS购自Sigma；大肠杆菌DH5α及BL21（DE3）均由本室保存；pMD-19T 克隆载体购自大连宝生物工程有限公司；pET-26b(+) 表达载体购自Novagen公司；Trizol RNA抽提试剂购自Invitrogen生物公司；PCR及胶中DNA回收纯化试剂盒、小规模质粒DNA提取纯化试剂盒购自中鼎生物技术有限公司；各种限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶及DNA标准Marker 购自大连宝生物工程有限公司；T4 DNA 连接酶购自北京纽英伦生物技术公司；低分子量标准蛋白Marker购自MBI Fermentas公司。引物由武汉伯杰生物技术公司合成；测序送上海英骏生物技术有限公司。

　　1.2   方法

　　1.2.1   PCR引物的设计： 以小鼠HMGB1 cDNA  GeneBank（NM 010439.2）查询的有效序列为模板，首轮PCR引物为：上游f1：5′-CGGGATCCCACTGGGCGACTCTGTGCCT-3′（引入BamHⅠ酶切位点及两个保护碱基），下游r1：5′-CGGAATTCTGCGCTAGAACCAACTTATTCATC-3′（引入EcoRⅠ酶切位点及两个保护碱基）。HMGB1目标基因的扩增引物：上游hmgb1-f2 5′-CGGGATCCGATGGGCAAAGGAGATCCTAAAA -3′（引入BamHⅠ酶切位点及两个保护碱基），下游hmgb1-r2 5′-CCCTCGAGTTCATCATCATCATCTTCTTCTTCA -3′（引入XhoⅠ酶切位点及两个保护碱基)。                             
　　1.2.2   总RNA的抽提及RT-PCR： 选择生长面积达瓶底70%的RAW264.7细胞，给予100 ng/mL LPS刺激，24 h后收获细胞。按照TRIZOL使用说明进行总RNA的抽提，50 μL灭菌去离子水溶解RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度。取4 μL用首轮PCR引物进行扩增，反应条件为：94 ℃ 5 min预变性，然后（94 ℃ 30 s；57 ℃ 25 s；72 ℃ 45 s）×35个循环，最后 72 ℃5 min，回收得到含HMGB1的697 bp片段，克隆至pMD-19T载体后转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定及序列分析证实为目标序列，将此重组载体命名为pMD-19T-HMGB1。以pMD-19T-HMGB1为模板，进行二次PCR扩增，反应条件为：94 ℃ 5 min预变性，然后（94 ℃ 30 s；57 ℃ 25 s；72 ℃ 40 s）×30个循环，最后72 ℃ 5 min。经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪下观察，回收648 bp HMGB1目的片段的PCR产物。

　　1.2.3   原核表达载体的构建与鉴定： PCR产物连接于pMD-19T载体，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得的重组质粒命名为pMD-HMGB1。用BamH+XhoⅠ进行双酶切，回收的目的片段亚克隆至经同样双酶切的原核表达载体pET-26b(+)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经质粒提取及酶切鉴定确定获得了重组的原核表达载体pET-26b(+)-HMGB1。

　　1.2.4   目的蛋白HMGB1的诱导表达： 以pET-26b(+)-HMGB1质粒转化感受态大肠杆菌BL21（DE3），挑取单个菌落加入到3 mL含25 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃、250 r/min，振荡培养至培养液变浑浊后加入终浓度为1 mmol/L的IPTG继续振摇2 h，行SDS-PAGE对蛋白表达进行鉴定。取获得HMGB1阳性表达的菌液50 μL，接种于200 mL新鲜的LB培养基，37 ℃、250 r/min过夜培养。次日晨加入1 mmol/L的IPTG诱导4 h后，离心收菌，弃掉上清并用15 mL预冷的PBS重悬沉淀，用超声波粉碎机破碎细胞，收集裂解后的上清液及裂解沉淀进行15% SDS-PAGE，以明确蛋白的可溶性。

　　1.2.5   目的蛋白HMGB1的分离纯化： 经SDS-PAGE明确HMGB1主要以可溶性形式存在于上清液中，收集上清液，过镍鳌合琼脂糖凝胶亲和层析柱（Ni-NTA）进行分离纯化, 分别用50 mmol/L、100 mmol/L 咪唑缓冲液洗涤杂蛋白，用300 mmol/L咪唑缓冲液洗脱目的蛋白，透析除盐。

　　2   结果

　　2.1.   获得HMGB1目标基因片段经反转录PCR获得含HMGB1的697 bp特异性条带，克隆至pMD-19T载体，经酶切鉴定及序列分析证实为目标序列，将此重组载体命名为pMD-19T-HMGB1。以pMD-19T-HMGB1为模板，进行HMGB1的PCR扩增,获得产物均与目标片段大小相符（648 bp）。见图1。

　　2.2   重组原核表达载体的构建与鉴定  将HMGB1的PCR产物克隆于载体pMD-19T，以BamH和XhoⅠ酶切pMD-19T- HMGB1， 回收目的片段，并将其亚克隆至经同样酶切的含pel引导肽及His-标签肽的原核表达载体pET-26b(+)，经酶切鉴定及序列分析证实已成功构建融合表达载体pET-26b(+)-HMGB1。见图2。

　　2.3   重组蛋白表达与纯化重组原核表达载体pET-26b(+)-HMGB1转化大肠杆菌BL21（DE3），37 ℃ IPTG诱导4 h，裂解细胞，将裂解液离心后分出上清与沉淀，经SDS-PAGE分析明确诱导产物主要以可溶性形式存在于上清液后。将含可溶性重组蛋白的上清液用Ni-NTA柱分离纯化，收集穿透液及各浓度的咪唑洗脱液，可见随着咪唑缓冲液浓度增加及洗脱次数增加，洗脱液中杂蛋白逐渐减少，至300 mM咪唑洗脱液中得到较高纯度的目的蛋白HMGB1。见图3。

　　3   讨论     

　　高迁移率族蛋白B1(High mobility group box1   HMGB1)虽然广泛存在于真核细胞内，但是不同的组织细胞，甚至相同组织细胞在不同生理状态下的表达情况并不一致［４］。体外实验观察到，LPS可引起人类外周血单核细胞及LPS敏感型小鼠巨噬细胞HMGB1的表达和释放［5、6］。为获得大量HMGB1模板，我们用100 ng/mL LPS刺激体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7，12 h后收获细胞抽提总RNA，RT-PCR结果显示获得了充足量的目的片段。RAW264.7细胞是被广泛用于体外巨噬细胞系，接受LPS刺激后RAW264.7细胞能表达和释放包括HMGB1在内的多种细胞因子。以它为研究对象的HMGB1基因克隆、原核表达和纯化的实验有简便和易于控制等优点。     

　　为了使目标蛋白在原核细胞中分泌型表达，减少原核表达的蛋白产物在细胞浆中过度聚集形成包涵体而导致生物学活性下降的可能，本实验选用pET-26b(+)质粒作为目的蛋白重组载体，这一载体在多克隆位点下游含有pelB信号肽，可以引导表达的蛋白进入细胞周间质，信号肽即被蛋白酶水解，而产生更加稳定的游离表达产物［７］。由于表达的蛋白可以在细胞周间质进行折叠，可能具有天然蛋白的构象，所以生物学活性较好。另外，pET-26b(+)质粒载体中含有由六个组氨酸组成的His-标签，与目标蛋白融合表达后便于通过Ni2+亲和层析柱进行分离纯化，而6×His标签一般不影响蛋白质的分泌或折叠，因此不会干扰蛋白的结构与功能，无须在纯化之后将其从蛋白上去除［８，９］。     

　　本研究成功构建了HMGB1原核表达载体，并且获得纯化的含His-标签肽的融合蛋白，为今后进一步研究其生物学功能奠定基础。

　　［１］   Erlandsson H H,Andersson U.The nuclear protein HMGB1 as a proinflammatory mediator.Eur J Immunol,2004,34(6)：1 503～1 512．

　　［２］   Yang H, Wang H,Tracey K J.HMG1 rediscovered as a cytokine.Shock,2001,15(4)：247～257．

　　［３］   Wang H,Bloom O,Zhang M,et al.HMGB1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice.Science,1999,285：248～251.

　　［４］   Muller S, Ronfani L, Bianchi M E.Regulated expression and subcellular localization of HMGB1,a chromatin protein with a cytokine function.Journal of Internal Medicine,2004,255：332～343.

　　［５］   Gardella S,Andrei C,Ferrera D,et al.The nuclear protein HMGB1 is secreted by monocytes via a non-classical , vesicle-mediated secretory pathway.EMBO Rep,2002,3：995～1　001.

　　［６］   Scaffidi P,Misteli T,Bianchi M E.Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation.Nature,2002,418(6　894)：191～195．

　　［７］   梁国栋主编. 最新分子生物学实验技术.北京：出版社，2001，280～287．

　　［８］   Dobeli H, Trecziak A, Gillessen D,et al.Expression ,purification ,biochemical characterization and inhibition of recombinant plasmodium falciparum aldolase.Mol Biochem Parasitol,1990, 41：259～268．

　　［９］   Lindner P, Gutll B, Wulfing C,et al.Purification of native proteinsform the cytoplasm and periplasm of Escherichia coli using IMAC and histidine tails : a comparison of proteins and protocols.Methods:A Companion to Methods in Enzymology,1992,4(2),41～55．