EB病毒潜伏膜蛋白1与肿瘤转移研究的进展
【关键词】 EB病毒 潜伏膜蛋白1 肿瘤转移
EB病毒(Epstein?Barr virus, EBV)与Burkitt's淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金病等密切相关。EB病毒编码多种蛋白,其中EB病毒潜伏膜蛋白1(Latent membrane protein?1, LMP1)唯一被确认具有癌基因功能而倍受学者关注。转移是恶性肿瘤最基本的生物学特征,也是影响患者预后的关键因素。同一种肿瘤, LMP1阳性表达的比阴性表达的更容易侵袭肿瘤旁正常组织和转移到淋巴结, LMP1与肿瘤转移过程中各阶段的众多影响因素有关,通过一系列复杂的调节促进肿瘤转移。
1 LMP1基因和蛋白
编码LMP1的基因是位于EB病毒基因组的U5?TR区的BNLF?1基因,转录产生2.8kb的mRNA,翻译合成62KD大小的LMP1蛋白。LMP1蛋白是由386个氨基酸残基组成的完整跨膜蛋白,分为三个区段:氨基末端胞浆区由24个氨基酸残基组成,接着是跨膜疏水结构区,有6个跨膜区和5个将其连接的环状结构(胞外3个,胞内2个),最后是由200个氨基酸残基组成的与信号传导有关的羧基末端胞浆区。跨膜区把LMP1锚在细胞膜上, 氨基末端和羧基末端游离于胞浆中。 羧基末端区是主要功能区,有三个重要结构域: 194～231氨基酸之间是CTAR1(Carboxyterminal activating region1),与肿瘤坏死因子受体信号相关因子2(TRAF2)结合激活NF?κB[1],与TRAF3结合促进EGFR表达;351～386氨基酸之间为CTAR2(Carboxyterminal activating region2),与蛋白受体相关致死功能蛋白(TRADD)结合后,通过TRAF6和TAK1( TGFβ?activated kinase 1)活化NF?κB[2],此外CTAR2还能激活AP?1,介导下游基因的表达; CTAR3位于两者之间即232～350氨基酸,参与Jak3/STAT通路的活化。
2 LMP1与肿瘤转移
恶性肿瘤转移是个连续过程:①一些肿瘤细胞从原发灶脱落;②分泌蛋白溶解酶溶解细胞外基质(ECM);③以阿米巴运动方式穿透基底膜、间质和血管壁进入血液循环;④与血小板等凝结成瘤栓随血流运行到达小血管,粘附于内皮细胞或基底膜;⑤穿出血管跟ECM及实质细胞粘附,生长形成转移灶,血管生成为其提供营养。对LMP1阳性表达的恶性肿瘤细胞的研究发现, LMP1与肿瘤的转移有密切联系[3]。
2.1 LMP1与细胞粘附性
肿瘤细胞从脱离原发灶到停留于转移部位继续生长都伴随着细胞粘附性的改变,实质上就是粘附与去粘附的不断交替。首先,肿瘤细胞同质粘附降低,彼此容易分离,从原发灶脱落。E?cadherin是研究比较多的同质粘附分子,它的丢失程度与浸润转移能力直接相关, LMP1抑制其表达而促进肿瘤转移[4]。有研究表明[5],LMP1通过促进DNA甲基转移酶1、3a和3b的表达和活化而使E?cadherin启动子高甲基化,进一步令E?cadherin表达减少,肿瘤细胞同质粘附下降,于是转移能力增强。在使用DNA甲基转移酶的抑制物之后, LMP1阳性表达的细胞内E?cadherin启动子得以表达并表现出活性,相应地肿瘤细胞的转移能力被牵制。
其次,肿瘤细胞同质粘附降低的同时,肿瘤细胞与间质细胞及基质的异质粘附增强也有利于肿瘤转移。然后,在血管内肿瘤细胞与血小板等形成瘤栓也是异质粘附增强的结果。最后,肿瘤细胞穿出血管、穿过间质、停留于转移部位无不体现着粘附与去粘附改变。研究显示在多种细胞中可观察到LMP1使ICAM?1表达上升, Mehl AM等［6］揭示LMP1是在CTAR1和NF?κB的共同作用下促进ICAM?1mRNA和蛋白表达的。有学者认为高表达ICAM?1的癌细胞通过LFA?1与淋巴细胞紧密结合随之迁移而脱离原位进入血液循环,在循环中易于形成瘤栓。在淋巴细胞中也可以观察到在LMP1激活NF?κB之后, ICAM?1相继表达。淋巴细胞粘附性增加,同样易于与肿瘤细胞结合,帮助肿瘤细胞转移。CD44在许多恶性肿瘤中异常表达,介导细胞与血管内皮、细胞外基质（ECM）成分粘附, 促进肿瘤细胞迁移, LMP1能诱导CD44的表达[7]。有研究表明Burkitt's淋巴瘤以形成局部完整结节为特征,而EBV相关的B细胞淋巴瘤往往散布于外周淋巴组织,接种到SCID小鼠体内形成结节的Burkitt's淋巴瘤细胞在转入LMP1基因后细胞膜表达CD44,并可见瘤细胞弥漫到周围的淋巴组织。给LMP1和CD44均阴性表达的Burkitt's淋巴瘤细胞转入CD44也可观察到与LMP1表达相应的弥漫生长方式。由此可见, LMP1可诱导CD44表达,进而促进肿瘤细胞的运动和迁移。
2.2 LMP1与基质降解
肿瘤转移的众多步骤里,ECM的降解极为重要。肿瘤细胞借助于降解ECM自身得以穿透ECM进入血管,而后从血管穿出并到达转移部位。降解ECM的蛋白水解酶主要包括基质金属蛋白酶(MMPs)、血纤维蛋白溶解酶原激活剂(PA)、组织蛋白酶B等。其中MMPs最为重要,在正常组织中表达量低,肿瘤中表达上升,几乎能降解ECM的所有成分,有助于肿瘤浸润转移。
LMP1能诱导MMPs的表达。Lu等[8]研究表明鼻咽癌中可观察到MMP?1表达, LMP1阳性表达的细胞内MMP?1的表达在转录水平、蛋白水平和酶的活性方面相应得到提高并且表现出更高的生物活性,肿瘤的转移能力得到增强,应用MMP?1的特异抗体则可以阻止肿瘤浸润转移。2个鸟嘌呤(2G)插入MMP?1的启动子内所形成的Ets结合位点能发挥更强的促进转录作用,Kondo等[9]进一步研究发现LMP1转染的携带2G/2G基因型的鼻咽癌细胞中LMP1正是通过Ets结合位点促进MMP?1表达和活化,增加肿瘤的恶性程度。
关于LMP1、MMP?9与肿瘤转移的关系目前研究甚多。体内和体外实验都显示LMP1的表达导致MMP?9表达增高,肿瘤运动、侵袭能力增强,此效应会被阿斯匹林或水杨酸类药物所抑制。Horikawa等[10]首次在鼻咽癌体外细胞株中观察到LMP1诱导MMP?9表达,提出LMP1通过MMP?9的效应引起鼻咽癌转移的观点。Gou等[11]研究证实,转染了LMP1的CNE1细胞MMP?9表达增加,肿瘤运动、侵袭、转移能力提高。Jeon等[12]研究也得出LMP1促进MMP?9表达,在鼻咽癌转移中扮演关键角色的结论。LMP1的CTAR1和CTAR2通过NF?κB和AP?1增强MMP?9表达,促进鼻咽癌侵袭与转移,水杨酸类药物抑制NF?κB和AP?1的活性后MMP?9的表达受到抑制也印证了这一机制。Zeng等[13]在野生型MMP?9?CAT质粒上应用点突变技术分别使MMP?9启动子区相邻的Ets和AP?1两个结合位点单独突变和共同突变,通过检测这三种突变体内报告基因CAT的活性来比较LMP1对MMP?9的作用,发现与野生型质粒相比,突变体报告基因的活性均下降,以两位点共同突变最为明显,说明LMP1正是通过MMP?9启动子区相邻的Ets和AP?1两个结合位点促进MMP?9表达的。用转录因子c?Jun、Ets1的硫代反义寡核苷酸分别行单独和共同阻断,发现阻断后LMP1介导MMP?9的作用均减弱,又以共同阻断最为显著,可见, LMP1可通过c?Jun和Ets1之间的相互作用介导MMP?9的表达[13]。
2.3 LMP1与血管生成
血管对肿瘤组织起着营养和支持的作用,并为肿瘤的浸润和转移提供了渠道。肿瘤的血管生成情况往往在肿瘤的分级、敏感性及预后方面有一定的评估价值。LMP1在肿瘤血管生成过程中起着重要的促进作用[4]。
鼻咽癌恶性度高,容易发生浸润、转移,这过程离不开血管生成。Murono等[14]的一系列实验揭示了LMP1通过两个重要的信号传导结构域CTAR1和CTAR2激活NF?κB,进而诱导环氧合酶2(Cyclooxygenase?2, COX?2)启动子和COX?2本身的表达,接着对鼻咽癌细胞的研究又证明了LMP1可以由下游的COX?2介导血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达, 特异性抑制COX?2则会使LMP1阳性细胞中VEGF的表达显著下降。Lo等［4］也证实了LMP1可促进VEGF表达。VEGF在血管生成中发挥关键作用,从早期血管形成时就开始了调节,使内皮细胞分裂和分化,形成管腔样结构并促进内皮细胞产生纤溶酶原激活物,增加血管通透性等。
在鼻咽癌细胞系中运用四环素控制LMP1的表达,发现LMP1以剂量依赖的方式促进表皮生长因子受体(EGFR) mRNA和蛋白的表达[15]。对LMP1转基因小鼠来源的肿瘤细胞系的研究也发现LMP1促进EGFR的表达,而且上调EGFR的磷酸化[16]。进一步研究发现, EGFR启动子上有两个NF?κB结合位点, 通过LMP1 的CTAR1和CTAR2激活的NF?κB作为中介活化EGFR启动子,促进EGFR表达[15]。磷酸化的EGFR处于活性状态,与配体EGF特异性结合以传递生长因子信号,促进血管内皮细胞有丝分裂,促进肿瘤新生血管形成。
在许多鼻咽癌组织中,IL?8呈现过度表达, IL?8的激活因子上有NF?κB的结合位点,LMP1由NF?κB途径实行对IL?8的调节,另外也可以通过AP?1来介导[17]。IL?8是多种恶性肿瘤的血管生成因子,可诱导周围正常组织中的血管内皮细胞迁移,为肿瘤的新生血管做铺垫。IL?8还能促进肿瘤细胞表达粘附分子和MMPs,从而促进肿瘤转移。
LMP1在上皮细胞通过C末端的CTAR1和CTAR2结构域激活NF?κB信号传导途径,介导成纤维细胞生长因子2(FGF?2)的表达和释放[18], IκB对NF?κB的效应能阻止LMP1对FGF?2表达及释放的促进作用。FGF?2是直接诱导血管生成的物质,在血管形成中是个不容忽视的因素,通过刺激血管形成而参与肿瘤的转移过程。由此亦可见, LMP1对血管生成起重要作用。
LMP1还与肿瘤转移存在着其他方面的联系。如LMP1通过ERK/Sp1信号传导途径抑制转移抑制基因RECK的表达, RECK表达减少在LMP1介导的肿瘤转移中是个关键步骤。Liu等［19］通过严谨的正反两方面实验进行了证实。
3 结语
EB病毒LMP1在肿瘤的转移中起着重要的作用,它与细胞粘附性改变、细胞外基质降解和肿瘤血管生成等均有密切的联系。对LMP1与肿瘤转移的深入研究将为进一步阐明肿瘤的转移机制提供可靠理论依据,对有效预防和EB病毒相关的恶性肿瘤的转移有着重大的意义。
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